腹部脂肪组织脂联素表达与新疆维吾尔族肥胖及2型糖尿病的相关性研究

为探讨脂联素(adiponectin,APN)m RNA表达与新疆维吾尔族肥胖及2型糖尿病的相关性。将样本分为3组:正常组(18.5 kg/m2≤BMI≤24 kg/m2)50例,肥胖组(BMI≥28 kg/m2)48例,2型糖尿病组(餐后2 h血糖≥11.1mmol/L空腹血糖≥7.0 mmol/L)16例,腹部择期手术时取其网膜脂肪组织,采用实时定量RT-PCR(real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction)对上述3组样本中的脂联素m RNA表达进行检测。采用SPSS17.0进行统计学分析。结果显示,肥胖及糖尿病组个体体重、腰围、臀围、腰臀比及体质指数均显著高于正常对照组,差异有统计学意义(P<0.01)。肥胖组男女性别间差异有统计学意义(P<0.01)。比较各组脂联素m RNA相对拷贝数后发现,正常对照组显著高于肥胖及糖尿病组,差异均有统计学意义(P<0.01)。同时肥胖组高于糖尿病组,但差异无统计学意义(P=0.753)。腹部脂肪组织脂联素m RNA相对拷贝数与BMI显著负相关(r=-0.334,P=0.045),与腰围显著负相关(r=-0.053,P=0.047),与血糖水平显著负相关(r=-0.129,P=0.017)。由此可知,腹部脂肪组织中脂联素m RNA的低表达是新疆维吾尔族肥胖及2型糖尿病发生的危险因素之一。

转录因子KLF7高表达与前列腺癌发生的相关性及其靶基因预测

目的探讨KLF7高表达与前列腺癌(PCa)发生的相关性,并对其可能的下游靶基因进行筛选。方法比较前列腺增生(BPH)患者(n=22)以及PCa患者(n=30)血糖、血脂及一般资料的差异;调取石蜡包埋的前列腺组织标本,运用免疫组织化学法检测组织中KLF7及其下游因子IL-6,以及肿瘤发生相关因子E-钙粘蛋白、Ki67的表达量。运用统计学方法,比较各因子在BPH和PCa患者前列腺组织中的表达差异,并分析KLF7表达与各因子之间的相关性。运用Cistrome Data Browser数据库对KLF7可能的下游靶基因进行预测。结果 PCa患者血清中总前列腺特异性抗原(TPSA)含量显著高于正常体检及BPH个体(P<0.001);PCa患者前列腺组织中KLF7及IL-6表达量显著高于BPH患者前列腺组织(P<0.05),肿瘤发生相关因子Ki67表达量显著高于BPH患者前列腺组织(P<0.05),E-钙粘蛋白的表达量在两组间无显著差异。相关性分析结果显示:前列腺癌组织中KLF7的表达与患者血清中TPSA含量显著正相关(r=0.465,P=0.001),与癌组织中IL-6的表达显著正相关(r=0.437,P=0.014),与癌组织中Ki67的表达显著正相关(r=0.434,P=0.002),与癌组织中E-钙粘蛋白的表达显著正相关(r=0.473,P=0.009)。生物信息学分析结果显示:转录因子KLF7可能通过调控肿瘤相关基因STAT3,DDX20,ZNF233,ZNF581,ZNF487,ZNF580,ZNF391,ZNF793,HMGB1,DMAP1,CTNNB1,ZBTB45等参与肿瘤的发生发展。结论 KLF7高表达可能是前列腺癌发生的危险因素,前列腺癌组织中KLF7的表达与IL-6、Ki67以及E-钙粘蛋白的表达显著正相关。KLF7可能通过调控一系列肿瘤相关基因的表达参与肿瘤发生发展的过程。

C17∶0激活GPR40受体的作用及信号转导分子机制研究

目的研究长链脂肪酸C17∶0对GPR40受体的激活作用,并探讨其介导的信号转导分子机制。方法在体外培养HEK293T细胞的基础上,免疫荧光结合共聚焦显微镜检测受体膜定位和内吞情况;通过多功能酶标仪检测Ca^(2+)流的强弱;Western Blot检测ERK1/2的磷酸化水平。结果免疫荧光结果显示:C17∶0可通过招募β-arrestin 2介导GPR40内吞;胞内Ca^(2+)动员检测结果证实:长链脂肪酸C17∶0可作用于GPR40引起胞内Ca^(2+)浓度升高;Western Blot结果显示:C17∶0可作用于GPR40诱导ERK1/2磷酸化。结论C17∶0是GPR40的内源性配体,通过激活Gaq和Gai/o蛋白介导的信号通路,引起胞内Ca^(2+)动员及ERK1/2的磷酸化。

脂肪酸通过内质网应激促进脂肪细胞miR-4431表达及释放的作用及机制研究

目的探讨棕榈酸(Palmitic acid,PA)对脂肪细胞内质网应激,以及对miR-4431表达及释放水平的影响,阐明肥胖后microRNAs表达及释放水平变化的可能分子机制。方法收集正常(n=6)及肥胖受试个体(n=6)腹部脂肪组织样本,qRT-PCR检测内质网应激标志物PERK、IRE1α、ATF6及miR-4431的表达水平。构建饮食诱导的肥胖小鼠模型,动态监测小鼠体重,评价小鼠葡萄糖耐量及胰岛素耐量,qRT-PCR检测小鼠附睾脂肪组织中PERK、IRE1α、ATF6、miR-4431的表达水平及血清中miR-4431的释放水平。体外培养小鼠胚胎成纤维细胞,诱导分化为成熟脂肪细胞后,使用200μmol·L^(-1)及500μmol·L^(-1)PA处理,qRT-PCR检测细胞PERK、IRE1α、ATF6及miR-4431表达水平及细胞培养上清液中miR-4431的释放水平。运用生物信息学数据库TransmiR和hTFtarget分析预测miR-4431上游的转录调控网络。结果(1)肥胖受试个体脂肪组织中内质网应激标志物PERK、IRE1α、ATF6及miR-4431的表达水平显著高于正常体重受试个体(P<0.05),且miR-4431表达水平与受试个体血糖及脂肪组织中PERK、IRE1α、ATF6的表达水平呈正相关;(2)同普通饮食对照组小鼠相比,高脂饮食喂养的肥胖小鼠血糖水平显著升高、葡萄糖耐量及胰岛素敏感性受损(P<0.05),附睾脂肪组织中内质网应激标志物PERK、IRE1α、ATF6、miR-4431的表达水平显著升高;同时小鼠血清中miR-4431含量显著增加(P<0.05),且与小鼠血糖、内质网应激标志物PERK、IRE1α、ATF6的表达水平正相关;(3)使用不同浓度PA处理诱导分化成熟的脂肪细胞后,细胞中PERK、IRE1α、ATF6、miR-4431的表达水平及上清中miR-4431含量均显著高于对照组(P<0.05)。(4)内质网应激相关转录因子参与了miR-4431的表达调控。结论肥胖后脂肪组织内质网应激可能是miR-4431表达增加的重要原因;高浓度棕榈酸可诱发脂肪细胞内质网应激,并促进miR-4431的表达及释放。

抗性淀粉含量不同的小麦品种(系)淀粉分支酶SBEⅡa和SBEⅡb基因多态性分析

【目的】克隆抗性淀粉含量不同的小麦品种(系)中淀粉合成酶关键基因SBEⅡa和SBEⅡb进行多态性分析,从分子水平阐述不同小麦品种(系)间抗性淀粉含量差异的原因。【方法】根据Gene Bank中公布的小麦SBEⅡa(AF286319.1)和SBEⅡb(AY740401.1)基因序列设计特异性引物,利用RT-PCR技术克隆SBEⅡa和SBEⅡb基因序列,利用Clustal.W进行测序结果的比对分析,NCBI Conserved domain和inte Pro在线网站对SBEⅡa和SBEⅡb氨基酸序列进行结构域预测,寻找影响抗性淀粉含量的主效基因位点。【结果】克隆了SBEⅡa(2 471 bp)、SBEⅡb(2 510 bp)基因ORF(open reading frame,ORF)全长。序列分析表明:SBEⅡa、SBEⅡb基因与公布的序列同源性分别为98.64%和99.07%。【结论】SBEⅡa基因ORF的三个结构域中未发现影响籽粒抗性淀粉含量的候选差异位点。在SBEⅡb基因编码区羧基C-末端的3个候选差异位点和α-淀粉催化酶结构域的1个候选差异位点可能是造成小麦品种(系)间抗性淀粉含量差异的原因。SBEⅡa、SBEⅡb氨基N-末端前面序列中共计10个单碱基变异作为潜在差异位点,也可能参与SBE基因的表达。

生殖细胞核因子及其相关因子在恶性生殖细胞肿瘤中的表达

为研究生殖细胞核因子(GCNF)及Oct-4在恶性生殖细胞肿瘤中的表达,揭示GCNF及Oct-4在恶性生殖细胞肿瘤中关系。运用免疫组化SP法分别检测41例男女生殖系统恶性肿瘤及8例无瘤变卵巢组织及10例无瘤变睾丸组织中GCNF及Oct-4的表达。结果显示GCNF在所有的恶性生殖细胞肿瘤及无瘤变的睾丸组织均呈阳性表达,定位于肿瘤细胞的细胞核,Oct-4在未成熟畸胎瘤,无性细胞瘤及精原细胞瘤呈阳性表达,定位于肿瘤细胞的细胞核,在其他类别的恶性生殖细胞肿瘤及无瘤变卵巢组织及睾丸组织中不表达。由此可知,GCNF和Oct-4在恶性生殖细胞肿瘤中的表达呈负相关,二者的表达强度可能与肿瘤细胞的分化状态有关。

小鼠精原干细胞体外分化中Stra8、mina53表达的研究

为检测Stra8、mina53在小鼠精原干细胞(mouse spermatogonial stem cells,mSSCs)体外分化中的表达,采用1)体外培养mSSCs并通过全反式视黄酸(ATRA,all-trans retinoic acid)进行诱导分化;2)通过间接免疫荧光反应鉴定mSSCs体外分化前后情况;3)通过RT-PCR检测mSSCs诱导分化前后(0h,2h,72h)Stra8、mina53mRNA的水平,初步了解Stra8、mina53的表达状况。结果表明:1)形态学变化显示ATRA使mSSCs向精母细胞方向发生了分化,并通过间接免疫荧光反应进行鉴定。2)Stra8在mSSCs诱导分化2h、72h的水平高于成年小鼠和未诱导分化的水平,其中72h时水平低于2h,各对照组间差异具有统计学意义。3)mina53的表达在诱导后增加,其水平高于成年小鼠和未诱导mSSCs的水平,但差异无统计学意义。这表明ATRA在体外使mSSCs向精母细胞方向分化,Stra8基因呈高表达,但mina53基因呈高表达不确定。

肥胖/糖尿病过程中大鼠不同部位脂肪细胞大小的比较

为比较大鼠肥胖/糖尿病过程中脂肪分布及脂肪细胞大小的变化,初步阐明脂肪细胞大小与2型糖尿病发生相关性。将Wistar雄性大鼠随机分为3组,每组12只:普通饮食组(正常对照),高脂饮食组(肥胖),高脂饮食+链脲佐菌素组(糖尿病组)。第0周随机抽取6只大鼠处死后,取皮下脂肪及腹膜内脂肪,用2.5%甲醛乙醇溶液固定,进行石蜡包埋,HE染色,制成切片。在400倍光学显微镜下随机选取10个视野检测统计脂肪细胞数量及面积大小(mm^2)。在饲养过程中分别选取第6、9、12、14周等4个时间点,每个时间点各组随机处死2只大鼠,取皮下脂肪及腹膜内脂肪进行相同处理。同时,在各个时间点对大鼠体重、血糖进行检测。各组大鼠皮下脂肪细胞与腹膜内脂肪细胞大小差异均有统计学意义(F=9.653,P=0.001;F=160.605,P=0.000),其中正常组与肥胖组、正常组与糖尿病组差异都有统计学意义,而肥胖组与糖尿病组差异无统计学意义。不同部位脂肪细胞大小的差异无统计学意义。脂肪细胞的体积增大,与大鼠体重及血糖变化相平行。大鼠脂肪细胞的体积增大与肥胖/糖尿病的演进过程相平行,大鼠脂肪组织的分布与脂肪细胞的大小无明显相关性。

FFA对巨噬细胞UCP2蛋白的影响

为检测游离脂肪酸对巨噬细胞解耦连蛋白2的影响,探讨肥胖与巨噬细胞解耦连的关系。采用培养RAW264.7巨噬细胞,分为空白对照组(基础培养液)、FFA组(基础培养液中加入FFA,终浓度为100μmol/L)和京尼平组(基础培养液中加入京尼平,终浓度为10μmol/L)。用Western blot的方法检测药物干预后UCP2与NF-κB磷酸化的表达水平。结果显示,与空白对照组相比,FFA作用于巨噬细胞24h后细胞内UCP2与NF-κB磷酸化水平均升高,差异有统计学意义(P<0.05);而京尼平作用于巨噬细胞24h后细胞内UCP2与NF-κB磷酸化水平均降低,差异有统计学意义(P<0.05)。由此可知,FFA能诱导巨噬细胞的线粒体发生解耦连,NF-κB磷酸化水平升高。

大鼠骨髓间充质干细胞向脂肪细胞、成骨细胞诱导分化及破骨细胞培养方法的建立

为建立稳定的大鼠骨髓间充质干细胞向脂肪细胞、成骨细胞诱导分化及破骨细胞培养的方法,为后续细胞共培养奠定实验基础。采用通过全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化大鼠骨髓间充质干细胞的方法,进行形态学观察,并应用流式细胞术检测BMSCs免疫学表型,对其进行鉴定;将获得的第三代BMSCs向脂肪细胞和成骨细胞方向进行诱导分化,诱导21 d后的脂肪细胞应用油红O染色进行鉴定,成骨细胞应用茜素红染色进行鉴定;将获取的骨髓细胞液按照造血系单核干细胞诱导培养法向破骨细胞方向进行诱导分化,于28 d后进行抗酒石酸酸性磷酸酶染色进行鉴定。结果显示,BMSCs体外培养14 d具有独特的细胞免疫学表型,流式细胞术检测,CD29+、CD44+表达量分别为97.92%和89.32%;在脂肪培养基诱导下,油红O染色阳性。在成骨培养基诱导下,茜素红染色阳性;骨髓细胞液在破骨培养基诱导下,抗酒石酸酸性磷酸酶染色阳性。由此可知,建立了稳定的大鼠骨髓间充质干细胞向脂肪细胞、成骨细胞诱导分化及破骨细胞诱导分化的培养方法。

游离脂肪酸通过FFAR4抑制脂肪细胞KLF15的表达和葡萄糖消耗

目的通过体外诱导3T3-L1前脂肪细胞分化为成熟的脂肪细胞,探讨肥胖个体中高水平的血清游离脂肪酸(FFA)是否抑制Krüppel样因子15(KLF15)的表达,并尝试探索其可能的分子通路。方法0.8 mmol·L^-1 FFA混合液(棕榈酸∶油酸=1∶2),刺激体外培养的3T3-L1成熟脂肪细胞,同时运用阻断剂AH7614和GW1100分别阻断游离脂肪酸受体4(FFAR4)和游离脂肪酸受体1(FFAR1),qRT-PCR和Western Blot技术检测脂肪细胞FFAR4、FFAR1、KLF15、Adipolin、GLUT4和磷酸化的p38 MAPK水平,葡萄糖氧化酶法检测上清液中葡萄糖浓度。结果(1)0.8 mmol·L^-1 FFA混合液能够显著促进脂肪细胞FFAR4的表达,抑制KLF15、Adipolin、GLUT4和FFAR1的表达和脂肪细胞葡萄糖消耗(P<0.05),同时对磷酸化的p38 MAPK无影响;(2)阻断FFAR4后,0.8mM FFA混合液对脂肪细胞KLF15、Adipolin、GLUT4的表达和葡萄糖消耗的抑制作用消失(P<0.05),对磷酸化水平的p38 MAPK无影响;(3)0.8 mmol·L^-1 FFA混合液作用于脂肪细胞的同时阻断FFAR1后,脂肪细胞KLF15和GLUT4的mRNA表达水平进一步降低(P<0.01),而Adipolin的表达,磷酸化的p38 MAPK和上清液葡萄糖浓度无明显变化。结论高浓度FFA可能通过FFAR4通路抑制脂肪细胞KLF15的表达和葡萄糖消耗。

FFA上调AMPK/Vimentin促进前列腺癌细胞PC-3的增殖、侵袭和迁移

目的探讨游离脂肪酸(Free Fatty Acid,FFA)对人前列腺癌细胞PC-3生物学行为的影响及可能机制。方法1. 5mmol/L FFA混合液(油酸∶棕榈酸=2∶1)刺激体外培养的PC-3细胞,CCK-8法检测对细胞的毒性作用,流式细胞仪检测对增殖的影响,Transwell法检测对侵袭、迁移的影响。细胞转染和RNA干扰技术上/下调AMPK。qRT-PCR技术检测AMPK、Vimentin及VEGF的mRNA表达水平。Western Blot检测蛋白表达水平。结果 (1)1. 5 mmol/L FFA混合液处理48h后,PC-3细胞的增殖、侵袭和迁移能力均显著增强(P<0. 05),细胞内AMPK、Vimentin及VEGF的mRNA表达显著升高(P<0. 05)。(2) 1. 5 mmol/L FFA混合液作用于PC-3细胞的同时下调AMPK,PC-3细胞的增殖、侵袭和迁移能力显著降低(P<0. 05),Vimentin的mRNA表达显著降低(P<0. 05)。(3)上调AMPK表达48 h后,PC-3细胞的增殖、侵袭和迁移能力显著增强(P<0. 05),细胞内Vimentin的mRNA表达显著升高,VEGF的mRNA表达显著降低(P<0. 05);下调AMPK表达24 h后,PC-3细胞的增殖、侵袭和迁移能力均显著降低(P<0. 05),细胞内Vimentin的mRNA表达显著降低(P<0. 05),VEGF则无显著变化(P>0. 05)。结论高浓度FFA可能通过上调AMPK增加Vimentin表达,促进PC-3细胞的增殖、侵袭和迁移。

基于RNA-Seq的子宫内膜癌灶与癌旁组织差异表达基因分析

目的 利用转录组测序(RNA sequencing, RNA-Seq)技术分析肥胖相关子宫内膜癌(Endometrial Cancer, EC)癌灶及癌旁组织中的差异表达基因,寻找肥胖相关EC发生、发展的相关危险因素。方法 对4例超重/肥胖伴EC患者的癌灶和癌旁组织进行转录组测序,筛选差异表达基因,并运用生物信息学技术对差异基因进行功能和通路富集分析。结果 在EC癌灶及癌旁组织中共筛选出2 451个差异表达基因,包含1 697个上调基因,754个下调基因。GO功能富集分析表明:肥胖相关EC的发生发展与细胞间粘附调节、有丝分裂进程和错误蛋白折叠结合等一系列生物学进程密切相关。KEGG功能富集分析表明:肥胖相关EC的发生发展与病毒致癌、细胞周期、Hippo信号通路、细胞凋亡和p53信号通路等密切相关。结论 Hippo信号通路、p53信号通路和NETs信号通路可能在肥胖相关EC发生发展过程中发挥重要作用。

油酸对子宫内膜癌细胞Ishikawa生物学行为的影响及机制初探

目的游离脂肪酸与肿瘤的发生发展密切相关,但在子宫内膜癌中的作用研究较少,本研究探讨不饱和脂肪酸油酸对人子宫内膜癌细胞Ishikawa生物学行为的影响及可能机制。方法将不同浓度OA刺激Ishikawa细胞作为实验组(OA作用组),并以空白组(未做任何处理)作为对照,用Cell Counting Kit (CCK-8)法检测OA对细胞毒性和增殖能力的影响,Transwell检测OA对细胞迁移、侵袭能力的影响。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测Bcl2、Ki67、MMP1、MMP9的mRNA表达水平。结果(1)不同浓度OA作用于Ishikawa细胞后,CCK8结果显示,50μmol/L、200μmol/L作用组细胞的活性在48 h显著高于空白对照组,差异有统计学意义(F_(48h)=2.504,P<0.05);500、1000、1500μmol/L刺激组细胞的活性在不同时间点均显著低于空白对照组,差异有统计学意义(F_(24h)=3.625,P<0.05;F_(48h)=9.318,P<0.01;F_(72h)=36.630,P<0.01;F_(96h)=47.871,P<0.01),对细胞具有毒性作用。(2)50μmol/L及200μmol/L OA作用Ishikawa细胞48 h后,细胞的增殖能力显著高于空白对照组,差异有统计学意义(F_(48h)=2.504,P<0.05),细胞的迁移及侵袭能力均显著高于空内对照组,差异有统计学意义(F_(迁移)=8.993,P<0.01;F_(侵袭)=6.560,P<0.01)。(3)200μmol/L OA作用于Ishikawa 24 h后,Bcl2、Ki67、MMP9的mRNA表达水平显著高于空白对照组,差异有统计学意义(F_(Bcl2)=7.232,P<0.05;F_(Ki67)=6.245,P<0.05;F_(MMP9)=3.837,P<0.05),MMP1的mRNA表达水平高于空白对照组。结论不饱和脂肪酸OA可能通过上调Bcl2、Ki67、MMP9等基因的表达,促进子宫内膜癌细胞Ishikawa的增殖、迁移和侵袭。

棕色化和白色化条件下脂肪组织KLF7的差异表达分析

目的观察棕色化和白色化条件下C57BL/6小鼠棕色脂肪组织(BAT)、腹股沟白色脂肪组织(iWAT)和附睾白色脂肪组织(eWAT)中KLF7蛋白表达水平的变化,为探讨KLF7对脂肪组织功能的影响提供实验基础。方法健康雄性C57BL/6小鼠36只,分为普通饮食组(n=6)和高脂饮食组(n=30),喂养8周,成功诱导肥胖模型后,将高脂饮食组随机分为室温处理组(n=6)、生理盐水处理组(Saline)(n=6)、β3肾上腺素能受体激动剂处理组(n=6)、4℃冷刺激处理组(n=6)和32℃热中性处理组(n=6),连续干预7天。观察不同处理后各组小鼠体重、摄食量、血糖、脂肪组织重量及形态变化,蛋白质免疫印迹法检测小鼠棕色脂肪组织、腹股沟白色脂肪组织和附睾白色脂肪组织中UCP1、PGC-1α和KLF7蛋白表达水平。结果4℃冷刺激处理组小鼠体重显著降低(P<0.01),血糖显著升高(P<0.01)。蛋白质免疫印迹法结果显示:KLF7在小鼠的棕色脂肪组织表达水平最高。高脂饮食组小鼠的棕色脂肪组织和腹股沟白色脂肪组织中KLF7表达水平升高。在β3肾上腺素能受体激动剂和4℃冷刺激处理的棕色化条件下,小鼠的3种脂肪组织中KLF7表达水平升高,而在32℃热中性处理的白色化条件下,3种脂肪组织中KLF7表达水平降低。结论棕色化条件可以促进小鼠3种脂肪组织中KLF7的表达,而32℃热中性的白色化条件下可以抑制3种脂肪组织中KLF7的表达,提示棕色化和白色化条件下可以改变不同脂肪组织中KLF7的蛋白表达水平,进而可能影响脂肪组织的生物学功能。