基于全基因组分析2017-2021年福建省猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组特征

通过对福建地区规模化猪场猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)进行病毒分离及全基因组序列分析,从而了解PRRSV流行情况及基因组特征,为猪场防控PRRS提供理论基础。2017—2021年从福建地区规模化猪场采集疑似感染PRRSV的组织病料和血清,进行病毒分离鉴定,采用RT-PCR方法对PRRSV分离株进行全基因组序列扩增,应用DNAstar 7.0软件进行序列分析,使用MEGA 7.0软件邻近法进行遗传演化分析,并利用生物软件SimPlot 3.51和RDP4.10对PRRSV基因组序列进行重组分析。成功分离得到32株PRRSV-2,其全基因组大小为14938~15439 bp(不包括ployA),32株PRRSV之间基因组核苷酸相似性为82.4%~99.4%,与PRRSV-2代表毒株(VR-2332、JXA1、NADC30、QYYZ)和PRRSV-1代表毒株(LV)之间核苷酸相似性分别为81.4%~99%和59.8%~60.6%。分别基于PRRSV全基因组与ORF5基因构建的遗传进化树对32株PRRSV进行分型,结果显示福建省呈现多种谱系毒株并存,两种分型结果符合率为75%(24/32)。PRRSV基因组中Nsp2和ORF5的变异程度最大,Nsp2蛋白存在不同程度的氨基酸(1~155aa)缺失,GP5蛋白主要中和表位发生广泛的变异。32株PRRSV存在较高的重组概率(27/32)且重组模式复杂多样,重组模式有9种:L1+L8、L1+L3、L8+L5、L8+L3、L1(Sublineage1.8+Sublineage1.5)+L8、L1+L5+L8、L1+L3+L8、L1+L3+L5、L1+L3+L5+L8,其中19株以NADC30-like PRRSV为主要亲本,重组方式主要为L1+L8和L1+L8+L3,重组热点主要分布在Nsp1、Nsp2、Nsp9和ORF3基因。综上,福建省主要流行毒株为以NADC30-like PRRSV为主要亲本的重组毒株,对PRRSV进行分型应当以全基因组结果为准。

东南地区猪圆环病毒2型检测及分子流行病学分析

【目的】分析我国东南地区2012-2018年规模化猪场猪圆环病毒2型(PCV2)的流行动态、基因组特性及病毒重组情况,为猪圆环病毒相关疾病(PCVAD)的防控和疫苗开发提供理论依据。【方法】对2012-2018年采自福建、江西、广东、江苏及浙江等省规模化猪场疑似断奶仔猪多系统衰弱综合症(PMWS)猪只的649份组织样本及血清样本采用PCR方法进行检测,对PCV2进行基因分型,并选取54份阳性样品进行PCV2全基因组同源性比对、系统发育分析和重组分析,同时对ORF2基因进行遗传进化分析和衣壳(Cap)蛋白氨基酸序列比对。【结果】东南地区猪场感染PCV2较普遍,PCV2阳性率为41.9%(272/649)。猪场存在PCV2a、PCV2b、PCV2d和PCV2e 4个基因型毒株,其中以PCV2d流行为主。基于PCV2全长核苷酸序列和ORF2基因的系统进化分析表明,54株PCV2毒株均分为4个基因型;PCV2e毒株检出率较低(仅为0.46%),其基因组全长1777 bp,与其他基因型代表毒株的全长核苷酸同源性较低(91.0%~93.0%)。重组分析表明,不同基因型毒株间存在重组现象。Cap蛋白的氨基酸序列分析表明,不同基因型具有特征性的突变位点。【结论】东南地区猪场存在4种基因型PCV2,其中PCV2d为优势基因型,不同基因型毒株间存在重组现象。新基因型PCV2e的检出率较低。

抗新城疫病毒HN蛋白单链抗体的原核表达及其功能鉴定

为制备抗鸡新城疫病毒(NDV)血凝素-神经氨酸酶(HN)单链抗体(scFv)并鉴定其生物学功能,本研究提取抗NDV HN单克隆抗体杂交瘤细胞株总RNA,通过RT-PCR扩增抗HN蛋白抗体的轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)编码序列,将其插入含有Linker序列的载体pET-scIG中,构建抗HN的scFv(HN-scFv)原核表达重组质粒pET-HN-scFv并在大肠杆菌中诱导表达。结果显示HN-scFv主要以包涵体形式存在。将包涵体进行复性和Ni-NTA层析柱纯化后用于流式细胞仪检测,结果显示复性纯化后的HN-scFv能够识别表达于293T细胞表面的NDV HN蛋白。该scFv的制备为进一步对该抗体进行改造奠定了基础。

饲粮中发酵豆渣添加水平对不同品种山羊营养物质消化代谢的影响

为了提高发酵豆渣在肉用山羊中的利用效率,本研究测定分析了发酵豆渣的常规营养成分含量,并开展了其在不同肉用山羊品种的消化代谢试验。试验以山羊品种和发酵豆渣添加水平为分析因素,采用双因素3×4随机区组设计,选取体况良好3个品种肉羊[努比亚山羊,体重(15.40±1.23)kg;闽东山羊,体重(15.38±1.32)kg;福清山羊,体重(15.46±1.27)kg]生长期羯羊各24只,随机分为4组,每组6个重复,每个重复1只羊。各组分别饲喂基础饲粮(对照组,CON组)以及添加10%(FSR10组)、20%(FSR20组)和30%发酵豆渣(FSR30组)的试验饲粮。预试期10 d,正试期7 d。结果表明:1)发酵豆渣的总能(GE)为16.07 MJ/kg,粗蛋白质(CP)、中性洗涤纤维(NDF)、酸性洗涤纤维(ADF)、粗灰分(Ash)、钙和磷含量分别为17.06%、52.81%、24.10%、3.40%、0.44%和0.18%。2)山羊品种和发酵豆渣添加水平的交互作用对干物质采食量(DMI)、平均日增重(ADG)、始重(IBW)和末重(FBW)的影响均不显著(P>0.05),而山羊品种和发酵豆渣添加水平均显著影响DMI和ADG(P<0.05)。3)山羊品种和发酵豆渣添加水平的交互作用对干物质(DM)、有机物(OM)、CP、GE、NDF和ADF的全肠道表观消化率的影响均不显著(P>0.05);发酵豆渣添加水平显著影响DM、OM、CP、GE、NDF和ADF的全肠道表观消化率(P<0.05),而山羊品种仅显著影响ADF的全肠道表观消化率(P<0.05)。4)山羊品种和发酵豆渣添加水平的交互作用显著影响尿氮、沉积氮、氮沉积率和氮生物学价值(P<0.05),而对氮摄入量和粪氮影响不显著(P>0.05)。FSR10组的氮利用效率优于其他各组,闽东山羊对饲粮中氮利用效率优于福清山羊和努比亚山羊。由此可见,山羊品种和发酵豆渣添加水平均能影响发酵豆渣的消化、吸收和利用;在体重一致的条件下,闽东山羊对发酵豆渣的氮消化利用能力优于努比亚山羊;育肥山羊饲粮中发酵豆渣的添加水平以10%~20%为宜。

hilA基因两端51bp序列对示踪标记性绿色荧光蛋白在禽肠炎沙门氏菌中倍增表达效率的鉴定

为构建表达绿色荧光蛋白(GFP)作为示踪标记的重组禽肠炎沙门氏菌(S.enteritidis)并鉴定其遗传稳定性,本研究通过重叠延伸PCR构建5'端含有T7启动子和核糖体结合位点(RBS),3'端含有T7终止子序列的增强型GFP(e GFP)表达盒,并将e GFP表达盒插入p MD18-T载体中构建p MD-e GFP原核表达重组质粒,将其转化于S.enteritidis。结果显示e GFP能够在S.enteritidis中持续表达。进一步将S.enteritidis hil A基因两端的51 bp序列分别添加到p MD-e GFP中e GFP表达盒的两端,构建p MD-He GFP重组质粒。荧光显微镜观察和流式细胞仪分析与p MD-e GFP相比,p MD-He GFP转化S.enteritidis后,其e GFP的荧光强度提高约30倍。通过在无抗生素选择压力下连续传20代次,重组S.enteritidis中e GFP仍然能够稳定表达。本研究结果为进一步研究S.enteritidis在动物体内的分布和定植规律等提供了一种具有荧光示踪标记的目标菌,并为其他细菌的同类研究提供了借鉴。

微生物制剂对肉鸡屠宰废水生物降解效果的研究

采用沼泽红假单胞菌、保加利亚乳杆菌,酵母菌和有效微生物群组成不同组合,以pH值、浑浊度、氨氮浓度、亚硝酸盐氮含量、BOD_5值和COD_(mn)值为考察指标,研究不同微生物制剂对肉鸡屠宰废水生物降效果,结果表明:沼泽红假单胞菌、保加利亚乳杆菌和有效微生物群以25:25:1的比例组成的复合微生物制剂,以0．01％为添加量时效果最好。

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因重组DNA疫苗的构建及其免疫效果评价

【目的】利用DNA改组技术(DNA shuffling)对不同谱系的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF5基因进行体外重组,构建具有良好交叉保护作用的DNA疫苗,为研制新型PRRSV疫苗提供参考。【方法】利用DNA改组技术对PRRSV谱系1、3、5.1、8.7毒株的ORF5基因进行体外突变重组,筛选去除信号肽的重组突变体。将重组突变体与真核表达载体pCAGGS-HA连接,构建重组表达质粒并进行酶切和测序鉴定,经脂质体转染MARC-145细胞,利用间接免疫荧光试验(IFA)和Western blotting试验检测目的蛋白的表达情况。将重组质粒pCA-ΔORF5-8和pCA-ΔORF5-46(ORF5基因重组的DNA疫苗)免疫小鼠,试验同时设pCAGGS-HA空载体组、PBS空白对照组、弱毒疫苗组(经典弱毒疫苗Ingelvac PRRS MLV,MLV组)和pCA-ORF5-MLV组(ORF5基因来自Ingelvac PRRS MLV),评估其免疫效果。【结果】筛选到2个去除信号肽的重组突变体(ΔORF5-8和ΔORF5-46)。成功构建重组表达质粒pCA-ΔORF5-8和pCA-ΔORF5-46,其可在MARC-145细胞中表达GP5蛋白。与pCAGGS-HA空载体组和PBS空白对照组相比,pCA-ΔORF5-8和pCA-ΔORF5-46组免疫小鼠血清白介素4(IL-4)和干扰素γ(INF-γ)含量均极显著提高(P<0.01),脾淋巴细胞增殖能力均极显著增强(P<0.01),均能产生针对GP5蛋白的抗体,血清中和试验表明,免疫组小鼠血清能对异源毒株产生交叉中和抗体(抗体平均滴度为10~16)。【结论】重组DNA疫苗pCA-ΔORF5-8和pCA-ΔORF5-46均能有效刺激并诱导机体产生细胞及体液免疫应答,具有良好的免疫原性。

同一猪场的2株基因重组猪繁殖与呼吸综合征病毒的遗传演化分析

为分析本实验室2017—2018年从同一规模化猪场临床病料中分离的2株猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的分子遗传特征,本试验采用PCR方法对分离毒株的全基因组进行扩增,并使用分子生物学软件Simplot 3.5.1和RDP 4.24对其进行遗传演化和重组分析。结果显示,分离毒株FJDJQ-2017和FJDJQ-2018基因组全长均为15016 bp(去除polyA后),2个毒株之间的核苷酸相似性仅为85.8%,与代表性毒株NADC30、QYYZ、VR2332和JXA1的核苷酸同源性分别为92.7%/89.4%、82.8%/84.4%、84.9%/84.7%和83.2%/84.5%;Nsp2氨基酸序列分析显示,2个毒株均存在类NADC30毒株特征性的(111+1+19)aa的不连续缺失;基于全基因组遗传演化分析表明,2个毒株均属于谱系1,而基于ORF 5基因的进化树分析表明FJDJQ-2017属于谱系3,而FJDJQ-2018属于谱系1;重组分析结果显示,FJDJQ-2017株是以类NADC30毒株为主要亲本毒株,以类QYYZ毒株和类VR2332毒株为次要亲本毒株的重组毒株,而FJDJQ-2018株是以类NADC30毒株为主要亲本毒株,以类QYYZ毒株和类JXA1毒株为次要亲本毒株的重组毒株。本试验结果丰富了PRRSV重组毒株的基因信息数据库,也为预防和控制猪繁殖与呼吸综合征提供了参考。

绿色高效饲料添加剂——小肽的研究进展

小肽营养的重要性已被人们所认识,就小肽的吸收机制、吸收特点、在动物营养上的作用及存在的问题综述了近几年在小肽营养上的研究成果。

鸭繁殖性状分子遗传研究进展

本文着眼于现代分子数量遗传新技术在鸭遗传育种中的应用前景,对鸭繁殖性状的分子遗传研究进行综述。介绍繁殖相关激素和调节因子的基因研究、与肝脏及卵巢中脂肪酸代谢相关功能基因的研究、与生长发育相关基因的研究等进展情况;同时介绍鸭分子遗传标记的开发和连锁图谱构建等方面的新进展。

类NADC30猪繁殖与呼吸综合征病毒FJZ03株感染性克隆的构建及鉴定

为构建类NADC30猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)FJZ03株的感染性克隆,本研究将该株病毒全基因组分成6段,通过同义突变将其中的A14378G,引入了Mlu I酶切位点为分子标记。经RT-PCR分别扩增后,克隆至改造后的载体pSK中构建中间质粒。经测序鉴定各质粒正确后,分段连接至pSK中构建全长cDNA克隆质粒pSKFJZ03。将鉴定正确的pSK-FJZ03转染Marc-145细胞并传代,收集出现CPE后的病毒液,经RT-PCR扩增后的产物经Mlu I酶切和测序鉴定;同时采用激光共聚焦试验鉴定,获得的拯救病毒命名为RvFJZ03。分别测定RvFJZ03在Marc-145细胞与潴肺泡巨噬细胞(PAMs)中的生长曲线,比较拯救病毒与亲本病毒的生长特性。将获得的拯救病毒RvFJZ03在Marc-145细胞中连续传代,对不同代次的重组病毒分别测定病毒效价,并经RT-PCR扩增后通过Mlu I酶切和测序鉴定。测序鉴定结果表明,正确构建了感染性克隆质粒pSK-FJZ03;将其转染Marc-145细胞后并传至第3代出现典型CPE,经激光共聚焦试验、RT-PCR及测序鉴定表明拯救了重组病毒RvFJZ03。不同代次拯救病毒的病毒效价在105.5 TCID50/mL^107.0 TCID50/mL,且不同代次的拯救病毒均能够检测到Mlu I酶切位点。病毒的生长曲线结果显示,拯救病毒RvFJZ03与其亲本病毒在Marc-145和PAMs中的生长曲线相似。本研究构建了FJZ03株感染性克隆,并拯救了重组病毒RvFJZ03,该拯救病毒能够稳定传代并稳定遗传Mlu I分子标记且与亲本病毒的生长特性一致。本研究为探究该类病毒的致病机制提供了技术平台。

复方中药芪苓制剂多糖超声提取工艺研究

研究超声波辅助法提取中药芪苓制剂多糖的工艺。通过正交试验设计L9(34)提取多糖,以蒽酮-硫酸法测定多糖含量,得出优化工艺的条件为:提取时间60min,提取温度80℃,料液比1∶10,超声功率300W。超声波辅助提取芪苓制剂多糖,能耗低,用时短,多糖得率5.96%,是传统方法的3倍,可以作为提取芪苓制剂多糖或其它中药多糖的首选方法。

ND-IBD二联灭活苗对100日龄种母鸡的免疫效果研究

本试验旨在研究鸡新城疫(Newcastle Disease,ND)-传染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease,IBD)(ND-IBD)二联灭活苗对种母鸡的免疫效果。选用100d种母鸡50只,随机选择25只皮下注射ND-IBD二联灭活疫苗作为免疫组,对照组注射灭菌生理盐水;采集血清检测种母鸡及各批次雏鸡的ND和IBD抗体水平;最后对各批次雏鸡进行攻毒保护试验。结果表明:(1)免疫组种母鸡在100d免疫接种ND-IBD二联灭活苗后,产生了较高的ND和IBD抗体;(2)免疫组和对照组子代ND和IBD抗体水平在20d内呈下降趋势,免疫组免后20d抗体水平高于对照组(P<0.01);(3)对照组和免疫组的子代ND和IBD抗体水平在四个时间段逐渐降低,另外,免疫组在种母鸡免后120d,其对应的子代ND和IBD抗体水平分别在第四批次15d和10d,仍然处于合格线之上。结论:种母鸡接种ND-IBD二联灭活苗之后产生了较高的ND和IBD抗体水平,种母鸡得到了很好的免疫,并且其免疫保护力能够持续120d,同时也可以提高子代的母源抗体水平。

猪繁殖与呼吸综合征类NADC30 PRRSV荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

为快速检测美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV-2)并从中鉴别诊断NADC30-like PRRSV,根据PRRSV-2的ORF6基因及类NADC30的2个靶点Nsp9和ORF5基因片段分别设计3对特异性引物和探针,建立了一种三重荧光定量RT-PCR检测方法。结果显示,Ct值与标准品在1×10^(9)-1×10^(1)拷贝/μL范围内存在良好的线性关系,R2均>0.990,最低检测浓度为10拷贝/μL;该方法特异性强,与其他基因亚型的PRRSV和其他主要猪源病毒无交叉反应;重复性分析结果显示,组内、组间变异系数均小于1%,呈现出良好重复性。应用建立的三重荧光定量RT-PCR检测方法对116份NADC30-like PRRSV样品进行检测,符合率为98.28%,对458份临床样品进行检测,2对引物单独使用时对NADC30-like PRRSV的检出率分别为36.03%(165/458)和32.3%(148/458),而2对引物同时使用时,NADC30-like PRRSV的检出率明显提高,为44.5%(204/458)。因此,本研究建立的三重荧光定量RT-PCR检测方法可用于PRRSV-2检测,可快速区分出NADC30-like PRRSV,可为PRRSV的防控提供技术支持。

肠炎沙门菌鞭毛蛋白的原核表达纯化及其多克隆抗体的制备

利用PCR技术成功扩增到了肠炎沙门菌鞭毛蛋白fliC基因,将其连接到原核表达载体pET-32a(+)中,构建原核重组表达质粒pET-32a(+)-fliC。将pET-32a(+)-fliC转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株中,并在30℃下用终浓度为1mmol/L IPTG进行诱导表达9h。表达的重组蛋白通过镍离子亲和层析和分子筛的方法进行纯化,获得的蛋白用SDS-PAGE方法进行分析。对纯化的重组蛋白进行定量和内毒素测定后,用其免疫SPF鸡,制备超免疫血清。纯化的FliC蛋白与其受体之间的相互作用通过流式细胞仪进行分析。结果显示,成功扩增到了长度为1518bp的全长fliC基因,该基因编码的蛋白在30℃下以可溶性形式表达,经过镍离子亲和层析与分子筛的方法获得的FliC蛋白的纯度高,其内毒素的含量低于0.5EU/mL,并能够结合该蛋白在细胞上的受体。用纯化的重组蛋白免疫鸡获得的阳性血清的效价为1∶12 800。上述结果为进一步研究FliC蛋白的免疫学功能奠定了基础。