绝经后女性中医症候群骨质疏松风险预测工具构建

目的构建中医证候的绝经后女性的骨质疏松(osteoporosis,OP)风险预测工具。方法问卷调查,收集研究对象一般资料、病史和中医症状,并进行骨密度检测。Logistic回归方法构建模型,并通过与常用预测工具OSTA指数比较及外部验证,分析其预测效能。结果年龄、体重、驼背和精神不振是OP危险因素,结合OP主要中医证候——肾虚证典型症状腰膝酸软、下肢抽筋、夜尿频多和耳鸣构建COPT模型。其ROC曲线下面积AUC=0.765,高于OSTA指数AUC;最优判断界值为>-0.79,灵敏度为69.43,特异性为72.60。外部数据验证灵敏度为68.85,特异性为75.00。结论中医证候表现在OP风险预测中具有一定作用,在本研究中,COPT模型预测效能优于OSTA指数,外部数据验证结果进一步支持COPT具有良好预测效能。

续苓健骨方联合阿仑膦酸钠调控EphB4/EphrinB2双向通路对去卵巢骨质疏松大鼠的研究

目的观察续苓健骨方联合阿仑膦酸钠对去卵巢快速骨丢失模型大鼠骨密度、结构、骨代谢和EphB4/EphrinB2信号通路的影响,探讨其作用机制。方法50只雌性SD大鼠随机分为5组:假手术组、模型组、续苓健骨方组、阿仑膦酸钠组和联合用药组,行双侧卵巢切除术制备模型;药物分别干预12周后取材,DXA检测股骨骨密度,HE染色观察胫骨组织显微结构,ELISA检测血清Ⅰ型胶原交联C末端肽(S-CTX)和Ⅰ型原胶原N端前肽(PINP)水平,Real-time PCR和Western blot检测腰椎EphB4、EphrinB2 mRNA和蛋白的表达水平。结果与假手术组相比,模型组骨密度显著降低(P<0.001),骨小梁稀疏并且排列紊乱,S-CTX和PINP含量均增高(P<0.01),骨组织EphB4、EphrinB2 mRNA和蛋白表达水平均显著降低(P<0.001)。与模型组相比,3个药物组骨密度均增高,其中以联合用药组最佳(P<0.001),骨小梁较密并且排列规则,S-CTX含量不同程度降低,PINP含量不同程度增高,EphB4、EphrinB2 mRNA和蛋白表达水平均增高。结论续苓健骨方联合阿仑膦酸钠起协同作用,可能通过激活EphB4/EphrinB2信号通路改善骨组织显微结构和血清骨代谢指标,从而提高大鼠骨密度起抗骨质疏松作用。

女性原发性骨质疏松症与中医肝脾亏虚的关联分析

目的探讨女性原发性骨质疏松症(primary osteoporosis,POP)与中医肝脾亏虚的关联性,为运用健脾、补肝法防治POP提供临床依据。方法对近15年来在我院骨质疏松专科门诊检测的女性3350例进行回顾性研究,结合问卷调查、骨密度检测和中医辨证,采用SPSS统计软件分析。结果纳入2692例,其中,POP组934例,无POP组1758例,POP组中肝虚418例(44.80%)、脾虚159例(17.00%),无POP组中肝虚803例(45.70%)、脾虚232例(13.20%),脾虚在两组间的差异有统计学意义(P<0.05),肝虚在两组间差异无统计学意义(P>0.05);②与无POP妇女相比,女性POP与脾虚、肝脾俱虚存在相关性(P<0.05);③二分类Logistic回归结果显示女性POP的危险因素包括年龄、脾虚(P<0.05)。结论肝脾亏虚是女性POP的重要因素;脾虚是女性POP发病的危险因素;肝虚在绝经后及老年妇女中发生率均较高,但不随着骨量丢失而进一步增加。

骨碎补-续断药对对成骨/破骨代谢的双向调控作用及其对Hif1ɑ基因的影响

目的分析骨碎补-续断药对对成骨/破骨代谢的调控作用并初步探讨其机制。方法分别制备空白、低剂量、中剂量及高剂量的骨碎补-续断含药血清。采用CCK-8法、ALP染色法和茜素红染色法,分别观察含药血清对MC3T3-E1细胞增殖、成骨和矿化能力的影响;采用CCK-8法和TRAP染色法观察含药血清对RAW264.7细胞增殖和破骨分化能力的影响。采用系统药理学的方法分析药物的可能作用靶点,并结合RT-PCR和Western-blot的方法验证。结果中剂量和高剂量骨碎补-续断含药血清可促进MC3T3-E1细胞的增殖,抑制RAW264.7细胞的增殖,中剂量组和高剂量组间没有明显差异;同时,中、高剂量含药血清可促进MC3T3-E1细胞的ALP活性和钙化能力,抑制RAW264.7细胞的TRAP活性,中剂量和高剂量间没有显著性差异。骨碎补-续断药对的可能作用靶点涉及HIF1ɑ,RT-PCR和Western-blot结果证实中剂量含药血清可提高MC3T3-1细胞Hif1ɑ基因的mRNA和蛋白水平及RAW264.7细胞的HIF1ɑ蛋白水平。结论骨碎补-续断药对具有促进成骨代谢,抑制破骨代谢的作用,HIF1ɑ可能是骨碎补-续断药对的一个重要作用靶点。

联合蛋白质组学和代谢组学探讨绝经后骨质疏松症肾虚证的分子机制

目的:从蛋白质和代谢物两种不同物质层面探讨绝经后骨质疏松症(PMOP)肾虚证的发病机制。方法:随机选取32例绝经后妇女,16例PMOP肾虚证患者为试验组,16名健康绝经后妇女为对照组。其中每组6例用于蛋白质组学分析,每组10例用于代谢组学分析。采用超高效液相色谱-串联质谱技术筛选组间差异蛋白质和代谢物。再对差异蛋白质和代谢物进行相关性的联合分析。结果:两组比较有113个差异表达蛋白质,其中28个上调和85个下调;两组比较有186个差异代谢物,其中115个上调和71个下调;联合分析发现11个差异蛋白质与9个差异代谢物存在相关性。其中蛋白质NEO1与胆红素(Bilirubin)显著负相关(P<0.05)。结论:PMOP肾虚证的分子机制可能与NEO1调控胆红素代谢通路密切相关。

中医心虚证与绝经后骨质疏松症的相关性研究

目的:通过分析心虚证与绝经后骨质疏松症的相关性,探讨绝经后骨质疏松症发生的中医病机。方法:研究纳入2 496例绝经后妇女,中医辨证分为心虚证组479例,无心虚证组2 017例。双能X线骨密度仪检测骨密度,并运用SPSS 23.0进行统计分析。结果:心虚证组股骨颈、大转子及Ward三角骨密度显著低于无心虚证组(P<0.05)。心虚证组骨质疏松症发病率高于无心虚证组(P<0.01)。Logistic分析结果显示骨质疏松症、高血压、冠心病均是心虚证的危险因素(B>0,P<0.05)。结论:中医心虚证与绝经后骨质疏松症存在相关性,可认为心虚是绝经后骨质疏松症的中医病机之一。

基于PERK/eIF2α/ATF4/CHOP通路探讨健骨颗粒对UMR-106细胞内质网应激凋亡的影响

目的探讨健骨颗粒含药血清对UMR-106成骨样细胞内质网应激ERS凋亡的影响和作用机制。方法选用UMR-106成骨样细胞,采用0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05μmol/L不同浓度的GSK2606414(PERK抑制剂)对细胞进行干预,采用CCK8法筛选GSK2606414最佳干预浓度。将生长状态较好的UMR-106细胞随机分为阴性对照组(NC组)、模型组(H_(2)O_(2)组)、健骨颗粒组(H_(2)O_(2)+JG组)和阳性对照组(H_(2)O_(2)+GSK2606414组)4组。NC组和H_(2)O_(2)组采用10%生理盐水血清干预12 h,H_(2)O_(2)+JG组采用10%健骨颗粒含药血清干预12 h,H_(2)O_(2)+GSK2606414组采用0.03μmol/L的GSK2606414和10%生理盐水血清干预12 h,除NC组外,其余各组在不更换新培养基的情况下,再分别加入10μmol/L H_(2)O_(2)干预12 h。采用激光共聚焦显微镜观察细胞内NC组和H_(2)O_(2)组GRP78和Caspase-12荧光表达情况,DCFH-DA检测活性氧(ROS)含量,激光共聚焦显微镜观察细胞内钙离子实时动态变化判断ROS/ERS模型是否成立。再采用An⁃nexin V-FITC/PI检测4组细胞晚期凋亡率,qPCR和Western blot检测4组ERS相关标志指标GRP78、PERK、eIf2α、ATF4和CHOP mRNA转录水平和蛋白相对表达量。结果与0μmol/L组比较,0.03μmol/L的GSK2606414是干预UMR-106细胞12 h后对细胞活力没有影响的最大浓度,故使用该浓度作为后续H_(2)O_(2)+GSK2606414组的实验干预条件。与NC组相比,H_(2)O_(2)组ROS含量显著增高(P<0.01),GRP78和Caspase-12的蛋白荧光表达量明显增加,细胞内钙离子流动速度加快并持续增高,表明H_(2)O_(2)诱导UMR-106细胞ROS/ERS模型的成功建立。与NC组相比,H_(2)O_(2)组凋亡率显著增高(P<0.05),GRP78、PERK、eIf2α、ATF4、CHOP mRNA转录水平和蛋白相对表达量均显著增高(P<0.01)。与H_(2)O_(2)组相比,H_(2)O_(2)+JG组和H_(2)O_(2)+GSK2606414组ROS含量显著降低(P<0.01),凋亡率显著降低(P<0.05),GRP78、PERK、eIf2α、ATF4、CHOP mRNA转录水平(P<0.05)和蛋白相对表达量(P<0.01)均显著降低。结论健骨颗粒可通过PERK/eIF2α/ATF4/CHOP信号通路缓解内质网过度应激,降低成骨细胞凋亡率,发挥防治绝经后骨质疏松症的作用。

不同滋阴补肾法干预去势大鼠破骨通路的机制

背景:六味地黄丸以“三补三泻”为配伍特点,补泻兼施以滋阴补肾;左归丸以“阳中求阴”为配伍特点,以阳促阴补肾。二者同属于滋阴补肾法,其在证候和细胞分子水平等都发挥较好的疗效。目的:观察六味地黄丸和左归丸在骨代谢中的作用,探讨其在破骨通路骨保护素(osteoprotegerin,OPG)/核因子κB受体活化因子配体(receptoractivatorofnuclearfactor-κBligand,RANKL)的作用机制。方法:将32只SD随机大鼠分为模型组、六味地黄丸组、左归丸组、假手术组,每组8只。除假手术组大鼠外,其余大鼠切除双侧卵巢制备骨质疏松模型。术后30 d开始六味地黄丸组大鼠灌胃六味地黄丸1.125 g/(kg·d);左归丸组大鼠灌胃左归丸2.25 g/(kg·d);假手术组和模型组灌胃生理盐水10 mL/(kg·d)。灌胃12周后,取大鼠胫骨检测骨密度,采用ELISA检测血清中雌激素E2、骨碱性磷酸酶、cAMP/cGMP水平,Westernblot法检测股骨中OPG/RANKL的表达情况。结果与结论:①与假手术组相比,模型组骨密度及雌激素E2、骨碱性磷酸酶水平降低(P<0.05),cAMP/cGMP水平升高(P<0.05)。②与模型组相比,六味地黄丸组和左归丸组骨密度显著提高(P<0.05);骨碱性磷酸酶均显著提高(P<0.05);左归丸组cAMP/cGMP水平明显降低(P<0.05)和上调OPG蛋白表达(P<0.05),六味地黄丸组上调OPG蛋白表达和下调RANKL蛋白表达均有作用(P<0.05);两组均不能显著提高雌激素E2水平(P>0.05)。③结果显示,“阳中求阴”的左归丸能够有效提高OPG表达,不能下调RANKL蛋白,而“三补三泻”的六味地黄丸能双向调节OPG和RANKL蛋白的表达,提示了六味地黄丸对抑制破骨功能方面可能比左归丸显著,此结论仍有待进一步的研究加以验证。

miR-148-5p靶向H型血管调控因子Slit3的实验研究

目的 观察绝经后骨质疏松症中H型血管调控因子Slit3表达差异,进一步探讨其上游靶向调控miRNAs。方法 雌性SD大鼠随机分假手术组和模型组,Real-time PCR和免疫组化检测骨组织Slit3 mRNA和蛋白表达水平;生物信息学预测可能与Slit3-3′UTR互作的miRNAs,构建野生型和突变型Slit3-3′UTR重组荧光素酶报告载体,和miRNAs表达载体共转染293 T细胞,双荧光素酶报告基因测定荧光素酶活性验证miRNA对Slit3-3′UTR的靶向作用。结果 与假手术组相比,模型组Slit3 mRNA表达水平略上调和平均光密度显著上调,生物信息学预测Slit3-3′UTR与miR-148a-5p、miR-148b-5p、miR-410-3p、miR-129-5p和miR-374-5p存在碱基结合位点,野生型Slit3-3′UTR共转染miR-148b-5p荧光活性下调至空白对照组的68.91%,突变型Slit3-3′UTR共转染miR-148b-5p荧光活性未见下调。结论 Slit3可能是绝经后骨质疏松症H型血管的调控基因,miR-148b-5p与Slit3-3′UTR的靶向结合直接调控Slit3的表达水平。

Raji-MG63细胞共培养体系中心肌营养蛋白样细胞因子1(CLCF1)对RANKL/OPG比值及成骨细胞分化的影响

目的探讨Raji-MG63细胞共培养体系中,心肌营养蛋白样细胞因子1(cardiotrophin-like cytokine factor 1,CLCF1)基因对骨保护素(osteoprotegerin,OPG)、核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of NF-κB ligand,RANKL)和成骨细胞分化的影响。方法通过CRISPR/Cas9基因编辑技术构建CLCF1基因敲除Raji细胞系,实验分2组:对照组(Control组)和CLCF1敲除组(CLCF1-KO组)。应用Transwell技术建立Raji-MG63细胞共培养体系,通过蛋白质印迹法(western blot,WB)检测CLCF1、OPG、RANKL及JAK2/STAT3蛋白的变化。运用碱性磷酸酶(ALP)活性检测和茜素红染色观察成骨细胞分化能力。结果WB结果显示,与对照组比较,CLCF1敲除组OPG(P<0.01)蛋白明显下调,RANKL/OPG比值升高(P<0.001),磷酸化JAK2(P<0.001)和STAT3(P<0.01)蛋白明显下调,差异具有统计学意义;ALP活性检测和茜素红染色结果显示,Raji-MG63细胞共培养体系中,CLCF1敲除组MG63细胞ALP活性和矿化形成能力降低,与对照组比较差异具有统计学意义(P<0.001)。结论CLCF1基因能通过调控RANKL/OPG比值和JAK2/STAT3通路影响成骨细胞分化。