基于生物正交点击化学修饰吲哚菁绿用于脂肪间充质干细胞活体示踪的实验研究

目的探究生物正交点击化学修饰可否用于脂肪间充质干细胞(ADSC)的吲哚菁绿(ICG)标记及活体示踪研究。方法收集小鼠脂肪组织进行ADSC的分离与培养,分别添加Ac4ManNAz、DBCO-ICG进行生物正交点击化学反应,评估该方法对ADSC细胞活性的影响,并利用共聚焦显微镜观察ADSC的ICG标记情况;将标记ICG的ADSC移植到急性肝损伤小鼠体内,利用近红外二区荧光成像开展ADSC的活体示踪研究,收集肝组织进行ADSC归巢性分析;最后,评估生物正交点击化学修饰对ADSC移植治疗急性肝损伤疗效的影响。结果生物正交点击化学可将ICG探针成功地修饰于ADSC细胞内,且不影响ADSC的细胞活性;标记ICG的ADSC移植到体内后主要分布、定位在肝组织内,说明ADSC具有肝向归巢性;生物正交点击化学修饰不影响ADSC改善急性肝损伤小鼠肝功能、减少肝细胞坏死的疗效。结论生物正交点击化学可用于ADSC的ICG探针标记及活体示踪研究。

基于TLR4/JNK/NF-κB通路探讨凉血解毒化瘀方治疗慢加急肝衰竭的作用机制

目的探讨凉血解毒化瘀方对慢加急性肝功能衰竭(acute-on-chronic liver failure,ACLF)模型小鼠的治疗作用及其对受体Toll样受体4(TLR4)/c-Jun氨基末端激酶(JNK)/核因子κB(NF-κB)通路的影响。方法采用四氯化碳、细菌脂多糖(LPS)和D-氨基半乳糖(D-GalN)联合诱导法构建慢加急肝衰竭小鼠模型;生化分析检测谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、总胆红素(TBIL)肝功能指标。肝组织病理学检查。荧光定量PCR检测肝组织白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、TLR4的mRNA表达。CCK8筛选凉血解毒化瘀方对Raw264.7细胞的干预浓度,酶联免疫吸附法检测巨噬细胞上清TNF-α、IL-6、IL-1β含量。蛋白免疫印迹法检测TLR4/JNK/NF-κB通路相关蛋白(TLR4、NF-κB、细胞外调节蛋白激酶(ERK1/2)、p-ERK1/2、p-JNK、JNK)的表达。结果与ACLF模型组比较,凉血解毒化瘀方可降低血清ALT、AST、TBIL含量,减少肝组织细胞坏死、纤维化、炎症细胞浸润程度,及肝组织TNF-α、IL-6、IL-1β、TLR4的mRNA表达,并降低肝组织TLR4/JNK/NF-κB通路相关蛋白表达。细胞实验进一步发现凉血解毒化瘀方可抑制巨噬细胞TNF-α、IL-6、IL-1β分泌,下调TLR4/JNK/NF-κB通路相关蛋白表达。结论凉血解毒化瘀方能有效改善ALCF小鼠肝功能、抑制其炎症反应的疗效,其机制与其下调TLR4/JNK/NF-κB通路有关。

凉血解毒化瘀方预防慢性肝损伤小鼠向急性肝衰竭转化及其对TLR4的调控作用

目的探讨凉血解毒化瘀方对慢性肝损伤小鼠向急性肝衰竭转化的预防效果及其对Toll样受体4(TLR4)的调控作用。方法取6周龄SPF级雄性BALB/c小鼠60只,采用随机数字表法分为正常组、模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组,每组12只。除正常组外,其余4组按体质量5 mL/kg腹腔注射20%四氯化碳(CCl4)以构建慢性肝损伤小鼠模型,正常组腹腔注射等剂量生理盐水,2次/周,连续8周。经组织病理学与血清生化分析证实慢性肝损伤造模成功后,低、中、高剂量组按体质量10 mL/(kg·d)分别灌胃0.75、1.50、3.00 g/mL凉血解毒化瘀方药液,正常组、模型组灌胃等剂量生理盐水,连续灌胃28 d后,模型组与各剂量组分别按体质量5 mL/kg一次性腹腔注射2μg/mL脂多糖(LPS)和0.2 g/mL D-氨基半乳糖(D-GalN)以诱导慢性肝损伤小鼠向急性肝衰竭转化,正常组腹腔注射等剂量生理盐水。3 d后采用生化分析法检测5组小鼠血清丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、总胆红素(TBIL)含量,HE染色观察5组小鼠肝组织病理形态变化,qPCR检测5组小鼠肝组织肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1β(IL-1β)、Toll样受体4(TLR4)mRNA转录水平,采用免疫荧光染色检测5组小鼠肝组织TLR4蛋白表达水平。结果与正常组比较,模型组血清ALT、AST、TBIL含量显著提高(P<0.05),HE染色结果显示肝组织出现肝细胞坏死,伴随大量纤维化改变及炎症细胞浸润,肝组织TNF-α、IL-6、IL-1β、TLR4 mRNA转录水平升高(P<0.05),肝组织TLR4蛋白表达水平增高。与模型组比较,各剂量组血清ALT、AST、TBIL含量降低(P<0.05),HE染色结果显示肝细胞坏死、纤维化,炎症细胞浸润程度减少,肝组织TNF-α、IL-6、IL-1β、TLR4 mRNA转录水平降低(P<0.05),肝组织TLR4蛋白表达量减少。与低剂量组比较,中、高剂量组血清ALT、AST水平降低更明显(P<0.05),HE染色结果显示肝细胞坏死、纤维化,炎症细胞浸润程度更轻,肝组织TNF-α、IL-6、IL-1β、TLR4 mRNA转录水平降低更明显(P<0.05),肝组织TLR4蛋白表达水平减少更明显。结论凉血解毒化瘀方可用于预防慢性肝损伤小鼠向急性肝衰竭转化,并具有抗炎作用,其机制可能通过抑制TLR4高表达而实现的。

核酸功能化纳米探针在细胞荧光成像中的应用

核酸是携带遗传信息的物质,既存在于自然界中也能够通过成熟技术人工合成。通过体外筛选技术还可以筛选出具有特殊功能的核酸序列,例如核酸适体和脱氧核酶。核酸通过沃森-克里克碱基互补配对原则进行杂交,具有很强的专一性。无论是通过序列设计还是体外筛选,核酸探针在生物标志物的分析与成像应用方面都发挥着重要作用。纳米材料辅助构建核酸功能化纳米探针,可以保护负载的核酸探针不被核酸酶降解,并且无需转染试剂就能进入细胞,在细胞荧光成像应用上具有很大优势。为解决细胞内有些生物标志物含量低、难于检测的问题,目前已构建多种适用于细胞水平的成像信号放大方法来实现对低丰度生物标志物的高灵敏成像。本文主要综述了核酸功能化纳米探针在细胞荧光成像中的应用进展,包括反义寡核苷酸功能化纳米探针、核酸适体功能化纳米探针、脱氧核酶功能化纳米探针等,同时介绍了他们在成像信号放大中的应用。

乙肝病毒X蛋白抑制高迁移率族蛋白B1的表达和活性氧的产生

目的观察乙肝病毒X蛋白（HBX）表达对宿主细胞高迁移率族蛋白B1（HMGB1）和活性氧（ROS）的影响。方法在正常肝细胞系LO2中过表达HBX蛋白；利用Western blot和ROS检测剂双氯荧光素（DCFH-DA）检测HMGB1的表达、ROS的产生和核因子（NF）-κB信号通路的变化；然后利用NF-κB和ROS的激活剂分别刺激细胞，验证NF-κB对HMGB1和ROS的调节作用。结果Western blot结果显示HBX的过表达显著抑制HMGB1的表达，下调2.4倍（P＝0.025）。通过对绿色荧光的观察发现HBX对ROS的产生具有抑制作用。Western blot结果证明HBX过表达可以抑制NF-κB（p65）及其抑制子IκB的磷酸化；鱼藤酮和LPS分别刺激HBX过表达细胞后发现，NF-κB（p65）及其抑制子IκB的磷酸化增强、HMGB1、ROS和Toll样受体4（TLR4）的表达量增加，提示HMGB1与NF-κB信号通路间是相互正调控关系。结论HBX通过抑制NF-κB信号通路，进而抑制HMGB1的表达和ROS的产生，同时抑制宿主细胞对炎性细胞因子的释放。

金属硫蛋白-1G对肝癌细胞增殖的影响

目的探讨金属硫蛋白-1G(MT1G)在肝细胞癌(HCC)恶化过程中发挥的调节作用及调节机制。方法利用无标记定量蛋白质组学技术比较MT1G过表达与参照细胞株之间蛋白质组差异;利用细胞计数试剂盒(CCK-8)、胸腺嘧啶核苷类似物染色试剂盒(EDU法)观察细胞表型变化;利用蛋白质印迹法(Western blot)检测相关信号通路关键因子表达量变化。样本间的比较采用t检验进行统计分析。结果首先成功构建出MT1G过表达细胞株。经质谱(MS)鉴定结果表明与参照细胞比共有182种蛋白在MT1G过表达细胞中出现表达量差异有统计学意义(阈值≥5.0倍或≤0.2倍,且P<0.05)。GO分析显示这些差异表达蛋白(DEPs)可能参与细胞周期调控和磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B(PI3K-Akt)信号通路。定量聚合酶链反应(PCR)验证表明与参照细胞比,MT1G在MT1G过表达细胞中上调表达,差异均有统计学意义(294.9±33.3)倍(t=8.837,P<0.01);吡多醛激酶(PDXK)上调表达(34.02±2.59)倍(t=13.148,P<0.01);UBX结构域蛋白7(UBXN)上调表达(19.08±0.47)倍(t=40.652,P<0.01);跨膜蛋白9家族成员4(TM9S4)上调(8.91±0.43)倍(t=20.485,P<0.01),这些结果与MS鉴定结果趋势一致,差异均有统计学意义。CCK-8和EDU染色结果揭示MT1G过表达可以显著抑制HCC细胞的增殖,而这种抑制作用是通过抑制Akt和雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的磷酸化实现的。结论MT1G通过调节PI3K-Akt信号通路活性抑制肝细胞癌细胞的增殖。

TACE-HAIC-靶向-免疫四联治疗中晚期肝细胞癌的回顾性对照研究

目的评价经导管动脉化疗栓塞术(TACE)-肝动脉灌注化疗(HAIC)-靶向-免疫四联治疗中晚期肝细胞癌(HCC)患者的疗效和安全性。方法根据入排标准入组101例中晚期HCC患者,分为联合组和对照组。联合组患者行TACE-HAIC-靶向-免疫四联治疗,对照组患者仅接受TACE治疗。对2组患者的总生存期(OS)、无疾病进展生存期(PFS)、治疗相关的不良反应进行统计分析。据资料不同采用t检验、χ2检验、秩和检验、Kaplan-Meier曲线、对数秩检验、Cox回归分析或Cox比例风险模型分析进行统计学分析。结果以mRECIST 1.1标准评估联合组肿瘤客观缓解率和疾病控制率分别为80%和94%,明显高于对照组的41.2%(P<0.001)和74.5%(P=0.007)。联合组的OS和PFS为15.6(95%CI 11.3~NA)个月和8.8(95%CI 6.9~12.0)个月,明显优于对照组的6.1(95%CI 5.3~6.6)个月(P<0.001)和3.2(95%CI 3.0~3.6)个月(P<0.001)。联合组胃溃疡发生率(9/50,18%)比对照组(2/51,3.9%)明显增加(P=0.023)。结论TACE-HAIC-靶向-免疫四联治疗对比单纯TACE治疗是一种更有效的中晚期HCC治疗方式,需注意对靶免治疗相关不良反应的监测。

循环肿瘤DNA对中国肝癌诊断价值的Meta分析

目的系统评价循环肿瘤DNA(ctDNA)在中国人群原发性肝癌(肝癌)中的诊断价值。方法检索PubMed、Web of Science、Embase、中国知网、万方、维普数据库中从建库至2021年11月关于应用ctDNA诊断肝癌的文献。中英文检索词为循环肿瘤DNA、ctDNA、游离DNA、循环DNA、cfDNA、血浆DNA、血清DNA,以及肝癌、肝细胞癌、肝肿瘤、肝脏肿瘤、原发性肝癌等。对纳入文献进行数据提取和质量评估后,采用Review Manager 5.3和Stata 15.1统计软件计算合并敏感度、特异度,绘制森林图和综合受试者操作特征(sROC)曲线并计算曲线下面积(AUC)。通过Meta回归分析和亚组分析分析异质性来源。绘制Deek's漏斗图检验发表偏倚。结果共纳入符合标准的文献25篇,包括4063例肝癌患者和3509例对照。其中5项研究为检测ctDNA浓度的定量分析,14篇为检测ctDNA中的肿瘤特异性单基因甲基化的定性分析,6篇通过ctDNA的特征构建模型进行诊断。定量研究组的合并敏感度、特异度及AUC分别为0.68(0.58~0.77)、0.82(0.71~0.89)和0.81(0.77~0.84);定性研究组相应为0.55(0.47~0.62)、0.99(0.93~1.00)和0.80(0.77~0.83);模型构建组相应为0.81(0.72~0.87)、0.91(0.85~0.94)和0.93(0.90~0.95)。Deek's漏斗图检验显示,定量研究组(t=1.080,P>0.05)、定性研究组(t=0.690,P>0.05)和模型构建组(t=0.230,P>0.05)均不存在明显的发表偏倚。结论ctDNA在我国肝癌诊断中具有良好的应用价值,利用ctDNA构建模型的诊断性能优于定量分析和定性分析。