基于CORDOVA的跨平台闽西生猪疫病APP的研究与实现

随着移动互联网的发展和智能手机的普及,基于B/S结构的信息系统已经不能满足用户的需要。分析了用户需求的基础上,研究和实现基于CORDOVA的跨平台闽西生猪疫病APP。APP不仅调用原系统的报表查询、病例查询和检测报表查询等功能模块,而且增加了预约采血、新消息、讨论区、新药新技术和防疫与保健等新功能。希望以此提高养殖户使用系统的粘性和丰富研究中心实验室的信息化管理方法。

2018—2020年福建地区猪瘟病毒E0基因遗传变异分析

为了了解2018—2020年福建地区猪瘟病毒流行及遗传变异情况,收集福建省不同地区临床发病猪的血液和肺脏、脾脏、淋巴结等组织样本1464份,采用RT-nPCR的方法对样品进行CSFV检测,对部分CSFV阳性样品E0基因进行克隆测序。结果显示,CSFV总体阳性率为1.9%(29/1464),并获得13株CSFV E0基因序列。同源性分析发现所得13株CSFV E0基因之间的同源性在82.2%-99.7%,其中11株CSFV E0基因与1.1亚型代表毒株HCLV的核苷酸同源性为99.0%~99.9%,与Shimen株的核苷酸同源性94.1%~95.0%;1株与2.1c型参考毒株HNSD-2012核苷酸同源性为98.2%;1株与2.1d亚型毒株CSFV/JPN/2018核苷酸同源性为99.6%。遗传进化分析发现,10株CSFV与HCLV、C-ZJ-2008、Shimen和Brescia处于同一分支,属于1.1亚型;1株CSFV与HNSD-2012等位于同一分支,属于2.1c亚亚型;1株与CSFV/JPN/2018等位于同一分支,属于2.1d亚亚型。氨基酸序列分析发现,13株毒株与HCLV等代表毒株在重要的Rnase活性位点高度保守,其中2株2.1亚型毒株与HCLV毒株相比,其在第35位非关键氨基酸残基上发生由G→E的突变。结果表明福建地区CSFV流行情况趋向多样化,提示仍需加强对CSFV流行及遗传变异的持续监测,为猪瘟的诊断及有效防控奠定基础。

抗体监测在规模猪场猪繁殖与呼吸综合征防控中的预警作用

为了揭示猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)抗体水平在免疫猪群与非免疫猪群中的变化规律,本研究选取福建省龙岩市两个规模相似的自繁自养猪场,其中一个场免疫国内某厂家的TJM-F92株,另一个场不进行免疫。试验采用ELISA方法对两个场不同周龄的商品猪进行PRRS抗体检测及分析,通过RT-PCR方法对临床样品中检测到的两株PRRSV的ORF5基因进行测序,并结合参考株进行序列分析。抗体检测结果表明,未免疫场248份血清中PRRS抗体阳性率从4周龄的70.0%下降至10周龄的26.7%,14周龄后抗体阳性率开始上升直至18周龄,保持在97.1%~100%;免疫场170份血清中未免疫的2周龄抗体水平较高,阳性率为100%,免疫后除6周龄、8周龄、10周龄分别为80%、70%、90%,其他周龄均为100%。ORF5基因遗传演化分析表明,免疫场检出毒株为HP-PRRSV,与HP-PRRSV(JXA1、HuN4等)、疫苗株HP-PRRSV TJM-F92等的同源性为70.5%~93.8%,并与JXA1、HuN4等处于同一小分支。未免疫场检出毒株与PRRSV NADC30株同源性为87.2%,属于NADC30-like分支。因此,当发现PRRS抗体阳性率较低、出现个别S/P值高且离散度大时,猪场要立刻采取处理措施预防因PRRSV感染而引起的继发感染。表明抗体定期监测在疫苗免疫场和阳性稳定场PRRS防控上可发挥有效的预警作用。

2013-2018年福建省部分规模化猪场猪伪狂犬病病毒野毒感染的流行病学调查

为了解2013-2018年福建省西南地区规模化猪场猪群伪狂犬病病毒(PRV)野毒感染情况,本研究分别采用PCR和ELISA检测方法,对2013-2018年该地区787个规模化猪场送检的1320份疑似发病猪群组织样品、3041场次的猪场67660份猪血清样品进行PRV病原学、血清学检测。结果显示:送检病例猪组织样品PRV野毒感染总阳性率为50.83%,场阳性率为52.60%;送检猪血清样品野毒感染抗体总阳性率为29.25%,场阳性率为61.13%。对检测数据进行分类统计,分析不同年份和不同猪群送检病例组织样品PRV野毒感染情况,发现2014年和2015年是福建省西南地区规模化猪场不同猪群猪伪狂犬病病毒野毒感染最严重时期;分析不同年份和不同猪群血清样品PRV野毒感染gE抗体,发现2015-2018年PRV野毒感染的猪场阳性率处于较高水平。不同猪群的猪存在一定比例的PRV-gE抗体阳性猪,但差别不明显。结果表明,福建省西南地区猪伪狂犬变异毒株流行后,规模化猪场猪伪狂犬病野毒防控形势更加严峻,提示应进一步加强伪狂犬病疫苗免疫的预防控制水平,并定期做好病原学、血清学监测,实时调整疫苗免疫程序,减少其他疫病的混合感染导致的猪场疫病控制更加复杂化。

福建省猪圆环病毒4型PCR检测及全基因组序列分析

为了解福建省猪圆环病毒4型(PCV4)流行株的现状和遗传演化,收集了2018年-2019年福建省规模化猪场200份疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的猪组织病料或血清,通过荧光定量PCR方法进行PCV4的核酸检测。结果表明,200份检测样品中PCV4核酸阳性的有4份,检出率为2%(4/200),成功克隆了1个PCV4全基因组序列(FJ-PCV4)。FJ-PCV4的基因组全长为1 770 bp,与国内PCV4代表毒株(GenBank登录号MK948416和MK986820)核苷酸序列同源性为98.8%~99.2%,与PCV1、PCV2及PCV3代表毒株Eng-1970、AF055392、AF055394、DK1980PMWSfree、BDH、 MN2016和MO2015等的核苷酸同源性为43.3%~52.0%,而与水貂圆环病毒Mink circovirus strain SD16、Mink circovirus strain MiCV-DL13同源性为68.1%~68.2%,表明PCV4是一种不同于PCV1、PCV2和PCV3的新型圆环病毒。研究结果为PCV4的分子流行病学研究提供了基础资料。

2018年福建省规模化猪场母猪繁殖障碍性疾病的流行病学调查

为了解2018年福建省规模化猪场妊娠母猪频繁发生流产、死胎的原因,试验采集福建省30个规模化猪场送检的流产死胎、血清及精液共230份病料,采用RT-PCR和PCR方法对引起母猪繁殖障碍的主要病原猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、乙型脑炎病毒(JEV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)及猪圆环病毒3型(PCV-3)进行检测和统计。同时对猪场主要病原的目的基因进行克隆、测序,利用分子生物学软件DNAStar 7.0对测序所得序列进行比对分析,利用MEGA6.0软件进行遗传进化分析。结果表明:30个猪场中PRRSV检出率为76.7%(23/30),PCV-2检出率为60.0%(18/30),PRV检出率为43.3%(13/30),PCV-3检出率为10.0%(3/30),其中PCV-2+PRRSV混合感染的猪场检出率为23.3%(7/30),PCV-2+PRRSV+PRV混合感染的猪场检出率为20.0%(6/30),PRRSV+PRV混合感染的猪场检出率为10.0%(3/30),PRRSV+PCV-2+CSFV混合感染的猪场检出率为3.3%(1/30)。23个猪场PRRSV ORF5基因之间的核苷酸相似性为95.1%~99.9%,与JXA1、CH-1a、NADC30、FJFS等参考毒株核苷酸相似性为92.1%~99.6%;18个猪场PCV-2 ORF2基因之间的核苷酸相似性为99.2%~99.9%,与BDH、AF055394、AF055392、Zhuji2003等参考毒株核苷酸相似性为99.2%~99.6%;13个猪场PRV gE基因之间的核苷酸相似性为99.2%~99.8%,与HBCX2013、NYXY、Ea等参考毒株核苷酸相似性为98.3%~99.7%。遗传进化分析结果显示,NADC30-like PRRSV、PCV-2d、PRV变异株成为猪场的优势毒株。说明引起规模化猪场母猪发生繁殖障碍性疾病的主要病原为PRRSV、PRV与PCV-2。

福建省谱系3 PRRSV的分离及其ORF5基因序列分析

对福建省新流行谱系3的PRRSV进行分离,并对其分子生物学特性进行初步研究,为新流行毒株的防治提供依据和参考。分离的毒株通过RT-PCR和IFA对PRRSV分离毒株进行鉴定,并对其ORF5基因进行序列测定分析。结果显示,分离株能够在Marc-145细胞上增殖并产生典型的细胞病变,被抗PRRSV的特异性单克隆抗体所识别,具有特异性免疫荧光,其TCID50为105.3,将其命名为FJFQ1805。分离株ORF5基因与北美型PRRSV参考株核苷酸同源性为83.9%~92.2%,与谱系3病毒株QYYZ的同源性最高,为92.2%。系统进化树分析表明,该分离株属于北美型,与QYYZ、GM2和FJFS等谱系3的病毒株属于同一分支。综上,所分离的FJFQ1805毒株为谱系3的病毒株。

福建规模化猪场O/A型猪口蹄疫病毒免疫抗体的检测与分析

为了掌握福建规模化猪场O型/A型猪口蹄疫病毒(FMDV-O/A)的免疫情况。应用ELISA法对2014年～2017年规模化猪场进行O型/A型猪口蹄疫病毒(FMDV-O/A)免疫抗体的检测,结果发现母猪、公猪、保育猪、育肥猪、后备猪的FMDVO抗体阳性率分别为93.6%、92.9%、55.4%、56.0%、82.6%;母猪和公猪一年四季的抗体阳性率较高(86%以上),保育猪和育肥猪冬春季节的抗体阳性率高于夏秋两季;不同厂家的猪口蹄疫疫苗使用效果各异;A型口蹄疫病毒总抗体阳性率62.4%,母、公猪的A型总抗体阳性率77.5%,商品猪抗体阳性率44.3%,2014年～2017年A型口蹄疫病毒抗体阳性率逐年上升。表明保育猪和育肥猪仍然是猪场口蹄疫防控的重点,A型口蹄疫病毒的免疫效果有待提高。本次检测结果为规模化猪场猪口蹄疫的有效防控提供参考。

福建省14株PRRSV-2全基因组特性分析

为了解福建省PRRSV的流行情况及分子特征,本研究选取14株不同年份不同谱系的PRRSV-2(lineage 3、lineage 8.7、lineage 5.1和lineage 1)进行全基因组扩增并测序分析。结果显示,福建省14株PRRSV-2基因组全长为15 016 bp^15 407 bp,与VR-2332、CH-1a、JXA1和NADC30的核苷酸序列同源性为82.9%~99.4%,14株PRRSV-2之间核苷酸序列同源性为82.1%~99.3%,差异较大。分离株FJCH、FJZH与JXA1-R疫苗株高度同源(99.5%~99.6%),且处于同一进化分支,推测其可能来源于疫苗株。重组分析显示14株PRRSV-2存在较高的重组概率(3/14),均发生在lineage 8.7和lineage 1之间。本研究为科学防控福建地区PRRS提供了参考数据。

福建省一株猪瘟病毒流行毒株全基因组序列测定与分析

根据GenBank公布的猪瘟病毒(CSFV)标准参考毒株全基因组序列,设计11对引物,应用RTPCR方法分别对11个片段进行福建流行毒株CN-FJLY的全基因组扩增,与参考毒株进行序列分析比较。结果表明,福建流行毒株CN-FJLY基因组全长为12 296bp,与参考毒株SXCDK、HEBZ、GXWZ02、HNLY-2011和Zj0801的全基因组核苷酸同源性为93.0%～97.0%,而与1.1亚群的中国强毒Shimen、疫苗株HCLV全基因组核苷酸同源性为84.4%～85.3%。基于全基因组及E2基因构建的遗传进化树分析结果表明福建流行毒株CN-FJLY属于2.1b亚群,与Shimen株、HCLV疫苗株亲缘关系较远。与HCLV相比较CN-FJLY基因组变异较大的是5′UTR、Ems、E2、p7、NS2、NS5A、NS5B和3′UTR。综上说明福建省猪瘟病毒流行毒株正在向远离疫苗株的方向变异。

福建省某规模化猪场种公猪精液PRRSV检测及ORF7基因序列分析

为了解福建省某规模化猪场种公猪猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的流行情况和流行特点。按照10%比例随机采集该场种公猪精液样本17份,通过RT-PCR方法对其进行PRRSV检测及ORF 7基因序列分析。结果表明,9份精液PRRSV呈阳性,样品阳性率为52.7%;遗传进化树分析表明,该猪场PRRSV ORF 7基因与QYYZ、GM2、FJFS等谱系3毒株亲缘关系较近,处于同一进化分支,而与VR2332、CH-1a、NADC30、JXA1和HuN4等亲缘关系较远,处于不同的进化分支,表明该毒株为近期新流行的谱系3的毒株。

猪细小病毒7型荧光定量PCR检测方法的建立与应用

猪细小病毒7型(PPV7)是近年来新发现的一种新型PPV。目前,缺乏更为高效的针对PPV7的检测方法,为了建立能够快速检测PPV7的方法,本研究根据PPV7 NS1基因的保守区序列,设计1对特异性引物及TaqMan探针。经过各反应条件的优化,初步建立了一种便捷、灵敏、能够快速准确检测PPV7的荧光定量PCR(qPCR)方法,并对其特异性、敏感性、稳定性以及与SYBR GreenⅠqPCR检测方法的符合率进行检测与对比。结果显示,该方法除对PPV7的基因组DNA有特异性扩增,对猪伪狂犬病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪轮状病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、日本乙型脑炎病毒及PPV1核酸均无交叉反应,特异性较强。该方法对重组质粒标准品检测限为1.76拷贝/μL,而常规PCR方法检测限为1.76×10^(2)拷贝/μL,表明本研究建立的方法敏感性较高。该方法对不同浓度质粒标准品的组内和组间重复性试验变异系数均小于1.7%,重复性较好。利用本研究建立的qPCR方法和SYBR GreenⅠqPCR方法对采自福建地区的150份样品进行检测,结果显示,两种检测方法的阳性率分别为24.67%(37/150)和6.67%(10/150),二者的总符合率为80.67%(121/150)。表明本研究建立的qPCR方法可以用于临床样品的检测。本研究建立的qPCR检测方法特异性强、敏感性高、重复性稳定性好,为PPV7的流行病学调查及检测提供了新的技术支撑。

福建NADC30-like PRRSV FJLY01株的全基因组分子特征分析

【目的】了解福建省NADC30-like PRRSV FJLY01株的分子生物学特征和遗传演化规律,为PRRSV的防控提供参考。【方法】对采自福建省规模化猪场的疑似病料进行PRRSV分离鉴定,以NADC30PRRSV毒株基因序列为参考设计并合成9对引物,分别对分离株序列进行分段PCR扩增,经克隆测序后进行序列拼接,采用MEGA 6.0软件进行核苷酸及氨基酸同源性比对,并绘制其与其他35株毒株的系统遗传进化树。【结果】FJLY01株基因组全长为15 016bp(不包含polyA),包含10个开放阅读框,5′-UTR长190bp,3′-UTR长148bp,Nsp2基因缺失393bp。Nsp2蛋白存在类似PRRSV MN184和NADC30株的131个氨基酸的缺失。核苷酸比对结果表明,FJLY01株与VR-2332、MLV RespPRRS/Repro、CH-1a和BJ-4株核苷酸的同源性为85.2%~86.3%,与JXA1、HuN4等HP-PRRSV株核苷酸的同源性为83.7%~84.1%,与MN184A、MN184B株核苷酸的同源性为87.9%~88.2%,与NADC30株核苷酸的同源性最高,为97.1%。系统进化树分析表明,该毒株属于NADC30-like毒株,与JXA1、VR2332和CH-1a的亲缘关系较远。【结论】福建省存在NADC30-like毒株,应该加强PRRSV的监测。

猪细小病毒7型VP2蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

为了表达猪细小病毒7型(PPV7)VP2蛋白(由Cap基因编码)并制备其多克隆抗体,试验从GenBank数据库中下载PPV7 Cap基因序列,选择不同毒株的高频序列作为目的基因序列,使用T4 DNA连接酶将目的基因与pET-32a表达载体连接,将连接产物转化至DH5α感受态细胞中,并使用IPTG对重组菌进行诱导,对表达的重组蛋白进行可溶性分析与纯化并通过Western-blot检测重组蛋白的反应原性,用纯化后的重组蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体并分别通过间接ELISA方法、Western-blot检测多克隆抗体的效价及其与重组蛋白的反应性。结果表明:诱导后的重组菌在56 ku处出现明显条带,重组蛋白主要以包涵体的形式表达;纯化后的重组蛋白为单一条带,质量浓度为0.46 mg/mL,能与His标签抗体特异性结合;制备的多克隆抗体的效价为1∶51200,能与重组蛋白特异性结合。说明PPV7 VP2蛋白获得了成功表达,该蛋白具有良好的反应原性和免疫原性,所制备的多克隆抗体效价较高。

艾叶水提液增强家兔抗大肠杆菌免疫的研究

用艾叶水提液给家兔饮水,通过ELISA技术和攻毒试验评价其对灭活大肠杆菌诱导特异性抗体反应和免疫保护作用的影响;利用ELISA、血常规、血生化、定量显色基质法以及RT-PCR等技术,对给药动物抗大肠杆菌(E.coli)固有免疫作用进行评估。结果显示,与对照组比较,艾叶饮水7 d能极显著增强灭活大肠杆菌诱导的血清特异性IgM、IgG抗体应答(P<0.01),且明显提高免疫动物感染E.coli后存活率;艾叶单独饮水能显著升高血清总IgG、IgA抗体水平(P<0.05),增加血液中性粒细胞(P<0.05)和血小板的数量(P<0.01),明显减少E.coli攻毒12 h后血液中E.coli数量(P<0.05)、LPS浓度(P<0.01)以及谷草转氨酶和谷丙转氨酶的含量(P<0.05)。另外,口服艾叶水提液能显著降低E.coli攻毒所致与LPS-TLR4通路相关的细胞因子(TLR4、TNF-α、IL-1β、IRF7、IFN-β)mRNA的过度表达(P<0.01或P<0.05)。结果表明,艾叶是一种优良的抗E.coli免疫增强剂,具有临床应用的潜力。

2020—2022年闽粤赣地区PRRSV ORF5基因的分子流行病学调查

【目的】了解闽粤赣地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的分子流行动态,为该疫病的科学防控提供参考。【方法】采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法对2020—2022年闽粤赣地区1475份临床猪组织和血清样品进行检测,对PRRSV阳性样品进行ORF5基因扩增和测序,并对ORF5基因的序列进行系统发育分析。【结果】2020、2021、2022年闽粤赣地区发病猪PRRSV的阳性率分别为24.23%(95/392)、27.69%(162/585)、18.07%(90/498),2020—2022年福建、广东、江西地区PRRSV的阳性率分别为23.20%(272/1172)、23.96%(52/217)、26.44%(23/87)。挑选来自不同猪场的86份阳性样品进行PCR扩增,成功获得62株PRRSV ORF5基因序列,并下载GenBank已发布的18株2020—2022年闽粤赣地区PRRSV的ORF5基因序列,与127株PRRSV国内外参考株ORF5基因序列构建系统发育树。系统发育树显示,80株闽粤赣PRRSV分离株均属美洲株。其中,40株分布在谱系1(NADC30-like株、NADC34-like株)上,12株分布在谱系3(GM2-like株、QYYZ-like株)上,7株分布在谱系5(VR2332-like株、BJ-4-like株)上,21株分布在谱系8(JXA1-like株、CH-1a-like株)上。对核苷酸和氨基酸序列的同源性进行分析,结果显示,80株PRRSV ORF5基因编码的核苷酸序列同源性为81.2%~100%,氨基酸序列同源性为78.6%~100%。33株PRRSV ORF5基因编码的GP5蛋白氨基酸序列在中和表位区第39氨基酸残基处存在变异。【结论】2020—2022年闽粤赣地区PRRSV流行株以谱系1为主(50.00%),并存在谱系1、3、5、8的混合流行。

福建地区猪流行性腹泻病毒E基因的克隆及遗传进化分析

为了解2013年~2016年期间福建地区猪流行性腹泻病毒(PEDV)遗传进化规律,收集了福建地区6份PEDV阳性样品进行遗传进化分析。结果表明:6株福建毒株E基因氨基酸序列同源性为99.5%~100%;遗传进化分析表明,6株福建毒株与经典毒株CV777、2010年前中国分离毒株LCZ的亲缘性较远,而与2010年后国内分离毒株以及2013年美国分离毒株亲缘关系最近。说明福建PEDV毒株属于目前国内外流行毒株,分子结构特征分析表明PEDVE基因具备高度保守的特性,可以作为设计疫苗的候选基因。

2019年福建某原种猪场猪繁殖与呼吸综合征病毒流行毒株ORF5基因的遗传变异分析

为确诊福建某原种猪场保育猪群临床暴发的疑似猪繁殖与呼吸综合征(PRRS),以及了解猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)毒株流行情况,从该猪场采集2周龄~8周龄各周龄段保育猪临床疑似发病猪全血各5份,将各周龄段5份血样各取50μL混匀,并分别命名为2W、3W、4W、5W、6W、7W、8W。利用PRRSV ORF5基因特异性引物通过RT-PCR方法进行检测,并对阳性结果进行ORF5基因序列分析。RT-PCR结果显示,2周~4周的保育猪全血中未检出PRRSV,5周~8周的保育猪全血中检出PRRSV。ORF5基因序列分析显示,5W毒株的ORF5基因与JXA1、HuN4和TJ等HP-PRRSV代表毒株同源性较高,为95.4%~95.6%,而与NADC30、VR2332、QYYZ等毒株的同源性较低,为82.7%~87.4%;6W、7W、8W毒株的ORF5基因与NADC30、FJZ03、FJY04和CHsx1401等类NADC30 PRRSV代表毒株同源性较高,为88.9%~91.6%,而与JXA1、VR2332、QYYZ等毒株的同源性较低,为83.3%~85.6%。基于ORF5基因构建的遗传进化树显示,5W毒株属于HP-PRRSV,6W、7W、8W毒株属于类NADC30 PRRSV。结果表明,该猪场保育猪存在类NADC30和HP-PRRSV毒株混合感染。研究结果可为福建省防控PRRS提供理论依据。

2020年福建地区4/6/7型猪细小病毒感染调查

猪细小病毒(PPV)是临床上造成母猪繁殖障碍的重要致病原,4/6/7型猪细小病毒是近几年发现的新型猪细小病毒,并且均已在流产胎儿中发现。为了解福建地区三种猪细小病毒的感染情况,本研究收集2020年福建地区68份发病猪血清和20份发病猪组织样品进行调查,发现PPV4、PPV6、PPV7在福建地区存在较高的感染率分别为9.09%、12.50%、37.50%。PPV4与PPV6之间存在着较高的共感染率,为5.68%,分别占PPV4、PPV6阳性样品的62.50%及45.45%。另外,本次调查发现PPV4、PPV6血清样品的检出率均低于组织样品,而PPV7在血清样品的检出率高于组织样品。本研究初步调查了2020年福建地区4/6/7型猪细小病毒的感染情况,为未来新型猪细小病毒的防控提供数据参考。

猪细小病毒6型研究进展

猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)是造成母猪繁殖障碍的重要致病原之一,并在世界范围内广泛流行,感染后可造成猪的死木胎综合征(Stillbirth,mummification,embryonic death and infertility,SMEDI),即母猪产死胎、木乃伊胎、胚胎发育不良和死亡及母猪不孕等[1]。PPV在临床上常与猪圆环病毒(PCV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)等病原产生共感染并引发猪的免疫抑制,给猪场带来巨大的经济损失[2]。