转录因子EN2在小鼠胚胎组织中的分布

目的观察转录因子EN2在小鼠胚胎发育过程中的时空分布规律。方法利用Westernblot技术检测EN2在小鼠胚胎E8．5-E17．5的表达强度；利用免疫组化技术观察EN2在胚胎发育不同时期各组织器官中的分布。结果①Westernblot：E8．5未检测到明显的阳性蛋白条带，E9．5-E15．5在相对分子质量为41×10。处检测到清晰的EN2蛋白条带，表达水平从E9．5-E12．5逐渐增强，E13．5之后逐渐减弱，至E16．5消失。②免疫组化：在胚胎不同时期，EN2蛋白在中后脑交界部、Rathke囊周围、下颌弓、视交叉、嗅球、椎间盘、轴旁肌和一些间充质组织中都有不同程度的表达。结论EN2蛋白可能参与了神经系统、骨骼肌、椎间盘和一些间充质组织的发育与分化。

胎牛血清对人胚胎神经干细胞分化的影响

目的 探索胎牛血清对人神经干细胞 (NSCs)的影响。方法 采用细胞培养、免疫组化、流式细胞仪检测的方法 ,观察了不同浓度胎牛血清对人NSC分化的影响。结果 胎牛血清促进人NSC分化为神经系统的主要的 3种细胞 (神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞 ) ,且培养基中胎牛血清浓度为 15 %时 ,人NSC分化为星形胶质细胞的数量占 80 %～90 %。结论 胎牛血清影响人NSC分化为神经元和神经胶质细胞的比例 ,并与胎牛血清的浓度有一定的关系。

体外培养神经干细胞分化为类胰岛样组织的研究

目的 观察体外培养的神经干细胞是否可以被诱导分化为类胰岛样组织。方法 体外培养神经干细胞 ,在胰岛素等外源性复合成分 (ITS)诱导分化后 ,分别进行胰腺上皮干细胞特异性标志物CK 19、胰腺 β细胞特异性成分胰岛素和胰腺α细胞特异性成分胰高糖素等的免疫细胞化学染色鉴定。结果 体外培养的神经干细胞经诱导分化 3d后 ,在神经干细胞集落附近可见散在或成群分布的上皮样细胞 ,并呈CK 19免疫阳性反应。继续培养 2～ 4周后 ,上皮样细胞增多 ,细胞圆形或呈鹅卵石样排列 ,进一步增生形成类胰岛样组织 ,其中大多数细胞呈胰岛素免疫反应阳性 ,少数细胞呈胰高糖素免疫反应阳性。结论 体外培养的神经干细胞具有向类胰岛样组织分化的潜能 ,它能分化为胰岛的α细胞和 β细胞。

昆明种系小鼠胚胎干细胞的分离培养及特性鉴定

目的 提高昆明小鼠胚胎干细胞 (ES细胞 )建株的成功率。方法 收集小鼠 3.5d的囊胚培养 ,用小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层 ,形成的ES细胞样集落 ,经两次亚克隆分离培养ES细胞 ;进行相差显微镜观察、碱性磷酸酶染色和体内外分化能力鉴定。结果 获得两个稳定ES细胞集落 ,传至第 11代。ES细胞呈集落样生长 ,碱性磷酸酶染色强阳性 ,体外分化的细胞沿拟胚体外向性生长 ,形态多样 ,在体分化可形成来源于 3个胚层的组织。结论 两次亚克隆法获得的细胞具有ES细胞主要的生物学性状 。

PCB_(153)诱导小鼠胚胎细胞凋亡对胚胎生长发育的影响

目的探讨环境雌激素多氯联苯同系物PCB153对发育过程中小鼠胚胎细胞凋亡的影响。方法于体外施予孕8.5d小鼠胚胎不同浓度PCB153,应用植入后全胚胎培养技术培养胚胎;采用原位TUNEL技术观察胚胎细胞凋亡。结果PCB153对胚胎发育具有明显影响且呈剂量-效应关系,且随PCB153浓度增加,凋亡细胞比值上升。结论PCB153能诱导胚胎细胞凋亡,这与其致胚胎发育异常有关,可能是PCB153的致畸作用机制之一。

“脑功复得”改善脑老化的基础研究

目的 研究中药合剂“脑功复得”口服液 (以下简称脑功复得 )对老龄大鼠学习记忆能力及大脑皮质海马突触泡膜素(Synaptophysin ,SY)、Tau 蛋白表达等的影响 ,探讨其延缓脑老化的功效及可能机制。方法 应用爬杆主动回避反应 (Activeavoidancereaction ,AAR)将动物分为学习记忆正常组和障碍组 ,再随机分别设置对照组 (普食 )和实验喂药组 (5ml/d ,2月 )。在此基础上进行AAR和多功能箱被动回避反应 (Passiveavoidancereaction ,PAR)训练、突触体计数、突触泡膜素和Tau蛋白免疫组化染色 (Immunocyto chemistry ,ICC)、凋亡细胞计数。结果 服用脑功复得 2月后 ,AAR习得率明显提高、消退明显延迟、步入潜伏期 (Stepthroughlatency ,STL)明显延长、大脑皮质海马突触体计数明显增高、突触泡膜素ICC染色增强、Tau蛋白ICC染色减弱、凋亡细胞减少。结论 通过动物实验说明从神经行为学和形态学指标看 。

大麻素受体在成年大鼠脑组织中的分布特点

目的:研究大麻素CB1、CB2受体在成年大鼠脑组织的分布特点和规律,为进一步研究其功能打下基础。方法:用兔抗鼠CB1、CB2受体特异性抗体免疫组化染色,检测大鼠脑组织主要部位两种受体的表达分布情况。结果:CB1受体阳性细胞在脑组织有广泛大量的分布,大脑皮质、胼胝体、海马、基底核区及小脑浦肯野细胞层、脑桥等区域均有较明显表达。CB2受体阳性细胞的数量及分布部位与CB1受体表达基本一致,少数区域如胼胝体、小脑白质阳性细胞数相差较大,CB2受体明显多于CB1受体的表达。结论:大麻素CB1、CB2受体在成年大鼠脑组织均广泛分布,并在多数部位表达情况一致,少数部位存在表达程度差异,提示其在神经系统中参与了某些生理及病理作用。

氯乙烯诱导小鼠胚胎神经管发育畸形的研究

目的观察孕早期不同剂量氯乙烯(VC)染毒后胎鼠神经系统发育以及神经上皮细胞增殖和凋亡的变化情况,明确VC对神经系统发育的致畸作用。方法将孕鼠21只按完全随机设计分组法分为实验组和对照组,实验组分别用不同剂量的VC对孕6.5 d的小鼠进行腹腔染毒,对照组注射花生油,均于E12.5取胚胎。观察胎鼠的表观发育情况,计算胚胎畸形率以及神经系统异常的发生率。运用PCNA免疫组织化学技术和TUNEL染色技术检测并观察神经管上皮细胞的增殖及其凋亡的变化。结果①中剂量VC组胎鼠活胎率下降,活胎中畸胎发生率高达51%,其中神经管畸形发生率占40%,与正常对照组相比差异有统计学意义(P<0.05);高剂量VC组胎鼠活胎率仅占55%,活胎中畸胎率明显增高占71%,其中神经管畸形发生率占50%,与正常对照组相比差异有统计学意义(P<0.01)。②中剂量和高剂量VC组胚胎神经管上皮厚薄不一致;高剂量组神经管多数呈明显未闭合状,神经管周围的间充质细胞肿胀,轮廓不清。③正常小鼠神经管神经上皮内可见PCNA阳性细胞与TUNEL阳性细胞分布;实验组各型阳性细胞分布与对照组相似,但随着染毒剂量的增加,PCNA阳性细胞表达减少,而TUNEL阳性细胞表达增多。结论孕早期一定剂量氯乙烯染毒可导致胚胎畸形率升高,神经管畸形率也相应上升。氯乙烯主要可抑制神经上皮细胞的增殖,诱导细胞凋亡发生增多,导致增殖与凋亡比例失调。

STAT3在小鼠胚胎神经系统发育中的表达

目的 观察STAT3在小鼠胚胎神经管发生和神经上皮分化迁移阶段的时空表达规律,为探讨STAT3在胚胎神经系统发生和发育过程的作用及可能机制提供形态依据。方法 采用全胚胎原位杂交技术和免疫组织化学技术,观察STAT3在神经胚形成和神经上皮分化迁移阶段的表达。结果 ①E8.75d整个鼠胚几乎没有观察到STAT3mRNA的表达,在E9.5d ,STAT3mRNA在前脑泡急剧增多,到E10 .5d ,阳性信号出现在中脑泡,E11.5d时在后脑泡的一狭窄区域有STAT3mRNA的表达;②E13 .5d ,在侧脑室周围即未来大脑新皮层区域、间脑、发育中的视网膜、第四脑室周围的脑组织(未来的脑桥)、脊髓、三叉神经节和背根神经节C1均可观察到较强的STAT3蛋白阳性信号,E14 .5d和E15 .5d时,大脑皮层、间脑、视网膜、第四脑室周围以及发育中的脑桥和脊髓等部位观察到中等强度的STAT3蛋白表达。结论 STAT3可能参与了神经管的关闭和神经上皮的分化和迁移。

小鼠胚胎干细胞NT3基因转染后移植对脊髓损伤的恢复作用

目的：由胚胎干细胞分化的神经细胞移植能够在一定程度上恢复脊髓损伤模型动物的功能,此发现使胚胎干细胞成为一种用于移植学研究的重要工具。观察经NT3基因转染修饰的小鼠MESPU35（ES-NT3）胚胎干细胞株移植对脊髓损伤动物脊髓结构和功能重建的恢复效果。方法：实验于2004-09/12在解放军第三军医大学组织胚胎学教研室实验室完成。①材料：清洁级成年Wistar大鼠36只,随机数字表法分为模型对照组、未转染细胞移植组、基因转染细胞移植组,12只/组,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。移植所用MESPU35细胞株和ES-NT3细胞株均由本室冻存。②实验方法：复苏MESPU35和ES-NT3细胞株,采用经典维甲酸4-/4＋法诱导两种胚胎干细胞神经定向分化,收集分化9d后的细胞,调整细胞终浓度至5×10^10L^-1备用。各组大鼠均建立L4脊髓损伤模型,在脊髓完全横断后10min内,基因转染细胞移植组分多点缓慢注入ES-NT3胚胎干细胞悬液,2μL/点,细胞总数约4×10^5个,注射位置为损伤区域白质与灰质交界处;未转染细胞移植组同法注射MESPU35胚胎干细胞悬液,模型对照组注射等量生理盐水。③实验评估：各组大鼠分别于术前、术后即刻、术后15d和30d进行后肢运动功能Tarlov评分检测,分数越低表示运动功能恢复越差。后肢运动功能检测30min后进行斜板实验,检测大鼠抓握和维持姿势能力。微型注射器将25%的辣根过氧化物酶2μL注入大鼠坐骨神经内,2d后取L1～L4脊髓常规冰冻切片,参照Mesulam法进行过氧化物酶逆行追踪。结果：因细菌感染,模型对照组、未转染细胞移植组、基因转染细胞移植组各死亡2只、1只、2只。①后肢运动功能检测：各组大鼠术后即刻后肢运动功能评分为0。术后15d,30d与模型对照组比较,未转染细胞移植组后肢运动功能评分升高（P〈0.01）,但未达到正常水平;基因转染细胞移植组恢复程度最高,后肢运动功能评分基本接近正常水平,明显高于未转染细胞移植组（P〈0.05）。②斜板试验：与后肢运动功能检测结果基本相似。③辣根过氧化物酶逆行追踪情况：模型对照组未见阳性神经元。术后30d基因转染细胞移植组阳性神经元增至最多,脊髓结构恢复情况优于未转染细胞移植组。结论：经NT3基因转染修饰的鼠MESPU35胚胎干细胞向神经定向诱导分化后,移植治疗脊髓损伤大鼠能更好地促进脊髓功能恢复和结构重建。

大鼠中枢神经系统结缔组织生长因子免疫反应阳性细胞的发育

目的 研究E8～P30 0大鼠中枢神经系统 (CNS)结缔组织生长因子 (CTGF)免疫反应阳性细胞的发育规律。方法 应用免疫细胞化学方法检测大鼠中枢神经系统CTGF免疫反应阳性细胞在不同发育阶段的变化情况。结果 出生前大鼠CNS未检测到CTGF免疫反应阳性细胞。出生后早期较少 ,而后逐渐增加。出生后 1～ 2月间出现发育高峰 :阳性细胞数量最多 ,分布范围广泛 ,阳性信号强。随年龄的增加阳性细胞数量逐渐减少 ,分布范围逐渐减小。阳性细胞主要是大脑扣带皮质、纹状皮质、海马、下丘脑、小脑的神经元和脊髓白质的星形胶质细胞、室管膜细胞。阳性细胞具长突起 ,且突起显示较强阳性信号。结论 CTGF在CNS的发育。

维甲酸对MESPU35胚胎干细胞系神经定向分化的影响

目的 了解维甲酸 (Retinoicacid ,RA)对MESPU3 5胚胎干细胞系诱导分化的影响。方法 小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层 ,培养MESPU3 5细胞系 ,4 4+法诱导其神经定向分化。结果 相差显微镜观察RA诱导MESPU3 5细胞系出现神经样细胞拟胚体百分率随分化时相点和RA浓度升高而升高 ,免疫细胞化学观察分化的NF2 0 0和GFAP阳性细胞随分化时相点和RA浓度升高而增加 ,NF2 0 0阳性细胞由无突起变为多极细胞 ,GFAP阳性细胞突起由短变长 ,最后联结成网状。流式细胞仪检测分化的GFAP、NF2 0 0阳性细胞比例变化与免疫细胞化学结果相符。结论 RA诱导MESPU3 5细胞系神经定向分化的调节以浓度和时间依赖模式进行 。

大鼠90%极限门静脉分支结扎后肝脏组织中IL-6的表达与肝增殖作用的相关性研究

目的探讨在大鼠极限90%门静脉分支结扎模型中门静脉压力促进肝再生过程中白介素-6(interleukin 6,IL-6)在肝脏组织中的表达及其与肝细胞增殖作用的关系。方法 72只Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠随机分成假手术对照组和门静脉分支结扎实验组。测定术后0.5、1、3、5、7、14d大鼠门静脉压力变化,观察实验组非结扎侧肝脏质量大体变化,光学显微镜下观察非结扎侧肝组织的病理形态变化,用免疫组化方法检测非结扎侧肝细胞的IL-6和增殖细胞核抗原(PCNA)的表达,并进行统计分析。结果①门静脉压力在结扎后立即升高,0.5d达到高峰(P<0.01),随后逐渐下降,7d左右降至正常水平。②非结扎侧肝叶质量逐渐增加,7d达"平台期";而结扎侧肝叶逐渐萎缩;非结扎侧肝细胞术后3～7d可见较多的分裂象,肝细胞核增大。③非结扎侧肝细胞中PCNA阳性细胞计数与对照组比较,0.5～5d表达增强(P<0.05),以后逐渐恢复正常。④非结扎侧肝叶IL-6的表达量与对照组比较0.5～5d表达增强,术后7～14d恢复至对照组水平(P>0.05)。⑤门静脉压力与非结扎侧肝叶肝细胞PCNA的表达在术后1、3、5d组呈正相关(r分别为0.816、0.774、0.827,P<0.05),在术后14d组呈负相关(r=-0.761,P<0.05);大鼠肝脏PCNA的表达在术后1、14d组与肝内IL-6表达呈正相关(r分别为0.813、0.825,P<0.05)。结论 IL-6蛋白在门静脉压力促进极限门静脉分支结扎致肝再生过程中发挥重要作用。

NT3基因的克隆、鉴定及高表达胚胎干细胞的构建与筛选

目的 从小鼠肝脏组织中克隆神经营养因子NT3基因 ,在此基础上构建能稳定表达NT3的MESPU3 5细胞株。方法 RT PCR扩增目的基因 ,克隆入穿梭载体pExchange 1neo ,酶切及测序鉴定。重组载体转染MESPU3 5胚胎干细胞株 ,G418长期筛选 ,RT PCR检测转染细胞NT3水平。结果 RT PCR得到长度为 777bp的基因片段 ,克隆后酶切鉴定正确 ,测序结果经BLAST对比 ,与GenBank中小鼠NT 3序列完全一致。成功构建了NT3真核表达载体及高表达细胞株。结论 从小鼠肝脏组织中PCR克隆了正确的NT3基因 ,所获得的NT3稳定表达MESPU3 5

交互式讨论教学法提高医学本科生综合分析能力的评价与实践

为了提高医学本科生自学与综合分析能力,作者以班级为单位将交互式讨论教学法应用于组织胚胎学实验教学中,分析并比较交互式讨论教学法组和传统教学法组实施后的效果。结果显示:交互式讨论教学法在提高学习兴趣和考试成绩、提高分析解决问题能力及提高综合素质等方面明显优于传统教学法。交互式讨论教学法能够有助于培养高素质的医学人才。

体外培养获得稳定高效胚胎干细胞滋养层的实验研究

目的筛选并优化获得稳定的胚胎干细胞（embryonic stem cells,ESCs）滋养层细胞的来源及其体外培养的最佳条件,为胚胎干细胞体外存活提供必要条件。方法分别取人工流产胎儿皮肤组织、昆明小鼠孕12.5、14.5、18.5d胚胎和新生鼠（P0）组织,分离培养原代胚胎成纤维细胞（embryonic fibroblasts,EFs）并传代制成滋养层。采用活细胞拒染法和免疫细胞化学染色等技术,观察并比较两种来源以及不同时相来源制备的滋养层细胞的功能状态差异。结果细胞活性状态：①人胚来源第1～5代成纤维细胞活性均好;但1～2代时杂细胞较多,此后可见深染色细胞逐渐增多。②E12.5d、E14.5d鼠胚来源的各代细胞均较同代E18.5d和P0来源的活性细胞数目高（P〈0.05）。以E14.5d第3～6代细胞最易培养存活。P0来源第6代与E14.5d来源同代细胞相比,深染变形细胞增多达30%。细胞分泌功能：①人胚来源第3～5代细胞I型胶原蛋白免疫阳性细胞数目少且染色较淡。②鼠胚来源的以E12.5d、E14.5d、E18.5d的第3～6代细胞免疫阳性细胞数目最多,且染色深;P0来源第6代细胞免疫阳性细胞染色深浅不一。结论采用人胚胎来源的成纤维细胞的活性尚可,但分泌功能稳定性欠佳。鼠胚E12.5～18.5d来源的第3～6代成纤维细胞,具有细胞活性强、分泌功能旺盛的特点,是作为胚胎干细胞赖以存活滋养层的最佳选择。

不同功能状态滋养层对人胚胎生殖嵴干细胞生长作用的实验研究

目的筛选并建立高效胚胎干细胞滋养层体外培养的最佳条件,利于人胚胎生殖嵴原始生殖细胞(PGC)的增殖。方法分离培养孕14.5 d(E14.5 d)和新生0 d(P0)昆明小鼠原代胚胎成纤维细胞(MEF)并传代制备滋养层,以60Coγ射线照射后继续培养并接种人PGC。采用活细胞拒染法、免疫细胞化学染色,对比观察滋养层的生长活性和照射后分泌功能;采用碱性磷酸酶(AKP)染色技术鉴定人PGCs的生长状态。结果 (1)E14.5 d和P0来源的第3～5代MEF生长旺盛。P0来源第6代与E14.5 d来源同代MEF相比深染变形细胞增达32%,经60Coγ照射后衰老细胞明显增多(P<0.05)。(2)E14.5 d来源第3～6代和P0来源第3～4代MEF经60Coγ照射后培养5 d时,Ⅰ型胶原蛋白免疫阳性细胞数目较多,染色较深;但P0来源第5代其阳性细胞数目明显减少,染色变浅。(3)人PGCs接种于E14.5 d第3代制备的滋养层3～4 d后见典型的ESC小克隆团,细胞呈圆形;AKP染色呈深蓝色团;而接种于P0来源第6代MEF制备的滋养层5～6 d,可见ESC克隆松散、变大,周围边界不清,细胞紊乱。结论以60Coγ射线照射小鼠E14.5 d来源第3～6代MEF是制备滋养层的最佳来源,可维持人PGCs增殖。