细菌生物被膜的耐药机制及控制策略

在特定的条件下,细菌可以形成生物被膜,包被有生物被膜的细菌称为被膜菌。被膜菌无论其形态结构、生理生化特性、致病性还是对环境因子的敏感性等都与浮游细菌有显著的不同,尤其对抗生素和宿主免疫系统具有很强的抵抗力,从而导致严重的临床问题,引起许多慢性和难治性感染疾病的反复发作。细菌生物被膜粘附在各种医疗器械及导管上极难清除,以至引发大量的医源性感染。近年来,随着人们对细菌致病机制认识的逐步深入,控制细菌生物被膜的方法已有较大发展。本文拟探讨被膜菌的耐药机制并着重综述细菌生物被膜控制方法的最新研究进展。

自然反义转录物:生物界中一种重要的基因表达调控分子

自然反义转录物(natural antisense transcript,NAT)是一种在原核和真核生物中具有重要基因表达调控功能的非编码RNA分子。NAT通常与其靶分子通过序列互补形成自然有义-反义转录物(natural sense-antisense transcript,NSAT)配对的双链R N A,引起靶分子的降解或翻译抑制。鉴于非编码R N A介导的基因调控生物学事件的普遍性,以及最近各种生物的大规模基因组测序的完成,对N A T进行高通量的筛选与深入研究显得尤为重要和迫切。

噬菌体内溶素的酶学特性及其应用前景

噬菌体内溶素是噬菌体在入侵宿主菌及侵染后期释放过程中合成的一类酶蛋白,该蛋白质能够破坏宿主细胞壁肽聚糖层。噬菌体编码的内溶素有四种类型:葡糖苷酶、酰胺酶、肽链内切酶和转糖基酶。大部分噬菌体内溶素由于缺少信号肽无法分泌表达,通常需要另外一种噬菌体编码的穴蛋白(holin)破坏细胞膜,然后才能够进入到细胞周间质裂解细菌细胞壁。大部分噬菌体内溶素可以特异地作用于自身宿主菌,同时也可以利用基因工程手段有目的地改造成功能特异的酶蛋白,因此可以用来作为生物制剂预防及控制微生物感染。

光化学作用对肿瘤细胞胞吞大分子的释放

目的观察不同光敏剂在肿瘤细胞内的分布,以及光化学作用对肿瘤细胞胞吞大分子的释放作用。方法使用激光共聚焦显微镜观察ALA、ALAHE、HMME、TPPSa2在肿瘤细胞SW480、K562的胞内分布,使用FITC右旋糖酐观察肿瘤细胞对荧光标记大分子的胞吞作用,通过光照激发光敏化细胞,动态观察光化学作用前后胞吞大分子FITC右旋糖酐的胞内分布变化。结果ALA、ALAHE、HMME、TPPSa24种光敏剂均表现为胞质分布,核内分布少。ALA、ALAHE的胞内分布主要表现为胞质内的弥散性荧光。HMME则表现为胞质内颗粒状荧光与弥散荧光同时存在。TPPSa2为典型的胞质内颗粒状荧光分布。光敏剂在SW480、K562两种肿瘤细胞的胞内分布没有明显差异。光照激发不同光敏剂对肿瘤细胞胞吞FITC左旋糖酐的胞内分布影响不同。由TPPSa2及HMME活化而产生的光化学作用表现出明显的荧光颗粒重分布,ALA、ALAHE则对胞吞荧光无明显重分布作用。结论不同光敏剂因其不同的理化性质而表现为不同的胞内分布。光化学作用可对肿瘤细胞胞吞大分子产生胞吞释放作用,其作用机制可能与光化学作用对胞吞泡的破坏有关。

多媒体教学中几个问题的思考

多媒体技术所具备的卓越能力,使其成为备受推崇的现代教育手段。然而多媒体教学也有一定的局限性,本文针对多媒体教学中常见的几个问题提出了自己的思考和见解。

补体受体1型的结构功能及sCR1基因克隆表达的策略

补体受体1型(Comp lem ent receptor type 1,CR1)具有外源性及内源性活性,既可灭活组装于非自身细胞膜上的C3/C5转化酶,也可灭活自身细胞膜上形成的C3/C5转化酶。CR1是唯一既对经典、替代及植物凝集素(MBL)3个补体激活途径的,对C3/C5转化酶拥有衰变加速活性,又有辅助1因子裂解C3b和C4b作用的补体调节蛋白。对补体分子的过度活化具有抑制和调节作用,在防治补体介导的缺血再灌注损伤以及异种器官移植超急性排斥反应等疾病中具有广阔的应用前景。本文主要综述CR1的结构功能及生物学活性,sCR1基因的克隆与表达及在创伤、缺血再灌注损伤中的应用研究现状。

NADase细菌毒素的活性测定

旨在建立一种测定ＮＡＤａｓｅ细菌毒素活性的非放射性测定法。本方法建立了一个ＮＡＤ（辅酶Ⅰ）依赖的显色系统，在该系统中，ＮＡＤ接受乳酸脱氢酶（ＬＤＨ）从乳酸脱下来的氢，再通过ＰＭＳ（吩嗪二甲酯硫酸盐）传递给ＩＮＴ（碘化硝基四氮唑蓝），使后者还原而显色。如果ＮＡＤａｓｅ毒素分解ＮＡＤ，就会打断递氢链而抑制显色反应。结果：显色系统中，ＮＡＤ含量与显色有良好线性关系（Ｒ＝０．９８９８）。绿脓杆菌外毒素Ａ分解ＮＡＤ而抑制显色反应。以毒素含量为自变量，以毒素对显色反应的抑制为应变量，建立了对数线性回归方程ｙ＝１２．５ｘ０．２６当ｙ＝５０％时［即显色系统中的ＮＡＤ有半数（２５０ｎｇ）被分解］，ｘ＝２０７（ｎｇ）。定义分解１ｎｇＮＡＤ的毒素活性为一个单位，则２０７ｎｇ毒素含有２５０个毒素活性单位。该方法的测定敏感性达到“ｎｇ”水平。

重组人补体受体1型SCR15-18片段对肠缺血再灌注损伤的保护作用

目的:探讨人补体受体1型功能域SCR15-18(CR1-SCR15-18)对大鼠肠缺血再灌注损伤的保护作用。方法:SD大鼠随机分为假手术组(SO)、缺血再灌注组(I/R)和CR1-SCR15-18保护组(CR1)。结扎肠系膜上动脉30 min,再灌注60 min,建立小肠缺血再灌注模型,再灌注前5 min注射CR1-SCR15-18蛋白(30 mg/kg)。测定肠黏膜血管的通透性、组织髓过氧化物酶(MPO)、超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量;HE染色观察小肠病理改变并根据Chiu's方法评分;免疫组织化学法检测补体C3组分的沉积。结果:与SO组相比,I/R组通透性增加,MPO活性和MDA含量显著升高,而SOD活性降低,肠黏膜病理损伤严重且有大量补体C3组分沉积。与I/R组相比,CR1组肠黏膜血管通透性显著降低,MPO活性和MDA含量显著降低,而SOD活性升高,肠黏膜损伤明显减轻,只有少量补体C3组分沉积。结论:CR1-SCR15-18蛋白抑制肠缺血再灌注时补体的活化,减轻肠组织损伤。

登革2型病毒与整合素β3相互作用机制的研究

目的观察登革2型病毒(dengue virus serotype2,DV2)感染后及转染DV2病毒蛋白的质粒后,EA.hy926细胞中整合素β3表达规律及表达量的变化,以初步明确DV2与整合素β3的相互作用的可能机制。方法经噬斑法测定DV2在EA.hy926中的增殖规律,并通过间接免疫荧光染色检测DV2感染后及病毒蛋白质粒转染后整合素β3表达量的变化。结果 DV2能够在EA.hy926细胞中增殖,在感染复数为1的条件下,最高病毒滴度为105pfu/ml,出现在感染后第5天,以后随着感染时间延长病毒滴度逐渐下降。DV2感染后整合素β3的表达量增高,且随感染时间的延长有渐增趋势;转染DV2E蛋白可诱导整合素β3的表达,且E蛋白与整合素β3有明显的共存,而DV2的其他病毒蛋白无明显诱导整合素β3表达的作用,且与之无明显共存。结论 DV2感染可诱导EA.hy926细胞整合素β3的表达,而E蛋白可能是DV2与整合素β3相互作用、进而介导病毒进入细胞的重要分子。

高致病性2型猪链球菌plcR基因敲除株的构建及其相关生物学特性的研究

【目的】构建高致病性2型猪链球菌05ZYH33菌株plcR基因敲除株,通过比较突变株与野生株生物学特性的差异,研究plcR基因在2型猪链球菌致病过程中的作用。【方法】利用同源重组技术敲除plcR基因,多重交叉PCR及RT-PCR鉴定并测序验证。比较野生株与突变株基本生物学特性的差异,小鼠攻毒实验分析plcR基因缺失对细菌毒力的影响。【结果】经RT-PCR证实05SSU0241与05SSU0242共转录,通过多重交叉PCR及RT-PCR证实成功构建plcR基因缺失突变株,基本生物学特性显示突变株的生长速率、菌落形态、溶血活性均无显著改变,小鼠致病性试验结果显示,野生株攻毒的小鼠死亡率为70%,突变株攻毒的小鼠死亡率为40%,毒力较野生株显著降低。【结论】plcR基因作为2型猪链球菌有毒株基因组中特有的外源基因,在细菌致病过程中具有重要作用。

铜绿假单胞菌噬菌体PaP4的分离与鉴定

【目的】鉴定一株新分离的铜绿假单胞菌噬菌体PaP4的生物学特性。【方法】双层琼脂培养法制备PaP4的单个噬斑,观察噬斑特点;用聚乙二醇8000浓缩PaP4颗粒后,再用氯化铯密度梯度离心纯化;用透射电子显微镜观察磷钨酸负染色的PaP4颗粒;提取PaP4基因组核酸,通过限制性内切酶图谱分析其核酸类型;按照感染复数(MOI)分别为0.000 1、0.001、0.01、0.1、1和10加入噬菌体纯培养液和宿主菌,充分裂解细菌后,测定噬菌体滴度;以MOI=10的比例加入噬菌体及宿主菌,进行一步生长实验,绘制一步生长曲线。【结果】PaP4的噬斑直径约3 mm 5 mm,圆形透明边缘清晰;PaP4噬菌体呈多面体立体对称的头部,直径约50 nm,有一个约30 nm的短尾;限制性酶切实验表明PaP4基因组为双链DNA;当MOI为0.001时PaP4感染其宿主菌产生的子代噬菌体滴度最高;用一步生长曲线描绘了其生长特性。【结论】PaP4属dsDNA短尾科裂解性噬菌体;最佳感染复数是0.001;由一步生长曲线得出感染宿主菌的潜伏期是25 min,裂解期是20 min,平均裂解量是150。

一株感染铜绿假单胞菌的双链RNA噬菌体PaP6的分离和鉴定

【目的】鉴定一株新分离的铜绿假单胞菌噬菌体PaP6的生物学特性。【方法】利用铜绿假单胞菌临床分离株PA038为宿主,从西南医院污水中分离得到一株裂解性噬菌体PaP6,观察其噬斑特点;氯化铯密度梯度离心纯化噬菌体颗粒后,用透射电子显微镜观察噬菌体形态;提取PaP6基因组,通过DNA酶和RNA酶酶切,做基因组酶切图谱分析;按照感染复数(MOI)分别为10、1、0.1、0.01、0.001和0.000 1加入噬菌体和宿主菌,裂解细菌后,测定噬菌体滴度;以MOI=10的比例加入噬菌体和宿主菌,绘制一步生长曲线;用112株铜绿假单胞菌临床分离株检测PaP6宿主谱。【结果】PaP6的噬斑直径约2 mm-4 mm,圆形透明,边缘清晰;PaP6噬菌体呈多面体立体对称的头部,直径约45 nm;酶切图谱表明PaP6基因组对DNase不敏感,对RNase敏感,未酶切基因组具有3节段双链RNA(dsRNA),长度分别约为9.0、4.5、3.5 kb,共约17 kb;当MOI为0.1时PaP6感染其宿主菌产生的子代噬菌体滴度最高,达到3.4×109 PFU/m L;用一步生长曲线描绘了其生长特性;PaP6可以感染40.1%的临床分离株,是一株比较广谱的噬菌体。【结论】首次报道了一株铜绿假单胞菌的ds RNA分节段噬菌体,分类学上属于囊病毒科,该噬菌体具有较广的宿主谱,在噬菌体治疗领域具有应用前景。