FasL基因修饰的树突状细胞的表型分析及其功能研究

目的研究FasL基因修饰后的树突状细胞(DC)的表型和功能的变化。方法以含小鼠FasL(mFasL)基因的重组真核表达载体转染小鼠骨髓来源的DC,FACS法检测DC表型的变化。将转染后DC与T细胞共同培养后,MTT法检测T细胞的增殖,Annexin V法检测T细胞凋亡。结果表型分析表明,FasL基因修饰的DC的CD80、CD86和MHCⅡ表达无变化。FasL基因修饰的DC能抑制T细胞的增殖,诱导T细胞发生凋亡。结论FasL基因转染的DC,其表型无明显变化,可抑制T细胞增殖,诱导T细胞凋亡。

负载卵蛋白壳聚糖纳米粒的研究:影响包封率的因素及其缓释效果

目的探讨影响壳聚糖(CS)纳米粒包封卵蛋白(OVA)的因素以优化包封条件,初步研究OVA体外释放规律,观察CS缓释OVA的作用。方法采用离子凝胶法,以三聚磷酸钠(TPP)为交联剂,制备CS纳米粒并包封OVA,检测其表征参数。观察CS浓度、CS/OVA质量比、CS/TPP质量比和CS溶液pH值对CS纳米粒包封OVA的影响,以及载OVA的CS纳米粒的OVA体外释放。结果载OVA的CS纳米粒平均粒径为496.7nm,Zeta电位为+29.41mV。增加CS浓度、CS溶液pH值和CS/OVA质量比,降低CS/TPP质量比可以增加CS对OVA的包封率。载OVA的CS纳米粒呈缓释模式,体外释放可持续6天以上。结论 CS浓度、CS溶液pH值、CS/OVA质量比和CS/TPP质量比是影响CS纳米粒对OVA的包封率的重要因素。CS纳米粒具有缓释OVA作用。

HSV_1-TK转染人肺腺癌细胞A549的实验研究

目的 体内外观察HSV1 TK/GCV对人肺腺癌细胞A5 49的杀伤效应。方法 构建含TK基因的逆转录病毒表达载体 ,电穿孔法转化肺癌细胞A5 49。MTT法检测转染细胞对GCV的药物敏感性 ,并观察旁观者效应 ;电镜、FCM、TUNEL法检测GCV诱导转染细胞凋亡变化 ;PCR和细胞原位杂交分别检测转染细胞TK基因整合和表达 ;活体内观察GCV对转染细胞、亲代细胞接种裸鼠皮下肿瘤治疗效果。结果 转基因细胞变得较不规则 ,多角型 ,易形成空泡。A5 49、A5 49 PLXSN、A5 49 TK三种细胞体外倍增时间分别为 ( 3 6.15± 3 .2 7)、( 4 0 .82± 3 .75 )和 ( 4 2 .0 6± 4.12 )小时 (P >0 .0 5 )。转染细胞对GCV的敏感性比亲代细胞提高 46倍 (P<0 .0 0 1)。旁观者效应在高细胞密度接种 ( 1× 10 4细胞 /孔 )较低细胞密度接种 ( 1× 10 3细胞 /孔 )明显。电镜发现转染细胞有凋亡小体、核呈半月征。FCM、TUNEL均能检测到转染细胞凋亡发生率明显高于对照细胞 (P<0 .0 0 1)。PCR及原位杂交表明转染细胞有TK基因整合和表达。体内实验表明GCV能明显抑制转染细胞接种的肿瘤 ,而亲代细胞接种的肿瘤未受抑制。结论 转TK基因细胞在体内外都获得了对GCV的敏感性。TK/GCV系统杀灭肿瘤可能与诱导细胞凋亡有关。GCV能在活体内抑制转TK基因细胞裸鼠移?

CD4^+T细胞功能性分化的研究进展

近年来关于CD4^+ T细胞功能性分化的研究包括CD4^+T细胞亚群的分化,CD4^+T细胞亚群的多样性、稳定性和T_(H1)、T_(H2)效应细胞的功能。这些研究有助于进一步探讨免疫性疾病的发病机理及治疗途径。

FasL基因转染树突状细胞对屋尘螨致敏/激发小鼠气道炎症影响的研究

目的研究FasL基因转染树突状细胞(DC)对屋尘螨致敏/激发小鼠气道炎症的影响。方法将FasL基因转染的DC和对照DC(未转染DC)分别经气管注入屋尘螨致敏/激发小鼠体内,病理切片观察小鼠肺部炎症,取支气管肺泡灌洗液(BALF),行BALF细胞总数及分类计数,ELISA检测BALF的白细胞介素-4(IL-4)、IL-5和γ干扰素(IFN-γ)水平。结果FasL基因转染的DC过继处理屋尘螨致敏/激发小鼠,能显著地减轻致敏/激发小鼠气道变应性炎症,减少BALF中细胞总数和嗜酸粒细胞比例,降低BALF中IL-4和IL-5的水平,增高IFN-γ水平。结论FasL基因转染的DC过继处理屋尘螨致敏/激发小鼠能抑制Th2细胞活化,抑制变应性气道炎症。

糖皮质激素吸入对咳嗽变异性哮喘患者呼出气NO水平的影响

目的观察咳嗽变异性哮喘(CVA)患者呼出气NO(FeNO)水平与气道炎症水平的关系,以及糖皮质激素对其的影响,并探讨其水平变化与气道炎症水平的关系。方法经支气管激发试验确诊的CVA患者14例,予以布地奈德/福莫特罗吸入剂吸入治疗,分别于治疗前及治疗6个月后测定其引起FEV1降低20%的乙酰甲胆碱浓度(PC20FEV1)、FeNO水平、诱导痰中嗜酸性粒细胞量及比例。结果 FeNO水平显著高于健康对照者,与PC20FEV1水平呈显著负相关,而与诱导痰嗜酸性粒细胞比例呈显著正相关。经布地奈德/福莫特罗吸入治疗6个月后气道反应性逐渐下降,其诱导痰中嗜酸性粒细胞比例亦显著下降。结论CVA患者FeNO水平显著升高,且此变化与患者气道炎症水平显著相关,而经吸入性糖皮质激素长效β2受体激动剂的联合制剂(ICS/LABA)治疗后,其水平显著下降,提示FeNO也许可以作为CVA患者气道炎症控制水平的标志。

雷公藤抑制致敏小鼠CD4^+T细胞核因子GATA_3、NFAT的活性

目的探讨致敏小鼠CD4`^+ T淋巴细胞核转录因子GATA_3、NFAT活性的变化及雷公藤内酯醇(TP)的作用。方法采用卵蛋白(OVA)致敏的方法建立模型;运用panni ng法分离CD4^+T淋巴细胞;通过凝胶电泳迁移率实验(EMSA)对CD4^+T 淋巴细胞核因子GATA_3、NFAT的DNA结合活性及TP的作用进行检测,同时就TP的作用与地 塞米松(DM)相比较。结果正常小鼠CD4^+T 淋巴细胞核因子GATA_3、NFAT的活性很弱,致敏小鼠CD4^+T淋巴细胞体外经伴刀 豆蛋白A(ConA)刺激后,GATA_3、NFAT的活性与正常对照组比较显著增强,并呈时间依 赖关系。经TP、DM处理后,GATA_3、NFAT的活性显著减弱。结论 GATA_3和NFAT是调控Th2类细胞因子基因转录的重要核因子。TP、DM抑制Th 2类细胞因子基因转录的分子机制可能与其抑制GATA_3、NFAT的DNA结合活性有关。

离子凝胶法制备壳聚糖纳米微粒的影响因素分析

目的研究离子凝胶法制备壳聚糖(CS)纳米粒的影响因素。方法离子凝胶法制备CS纳米粒,观察CS浓度、三聚磷酸钠(TPP)浓度、CS/TPP质量比和CS溶液pH值对CS纳米粒制备的影响。结果 CS溶液pH值为3.5～5.0,浓度0.5～2.5 mg/ml,CS/TPP质量比为6∶1～12∶1时可得到稳定的CS纳米粒乳光溶液。CS浓度增加和CS/TPP质量比降低均可导致CS纳米粒粒径明显增大。CS浓度增加、CS溶液pH值减小可引起CS纳米粒Zeta电位增高。结论 CS浓度、CS/TPP质量比和CS溶液pH值是制备CS纳米粒和影响CS纳米粒特征的主要影响因素。

FasL和Der p2双基因共表达真核表达载体的构建及其在树突状细胞中的表达

目的构建小鼠FasL基因和屋尘螨主要抗原Der p2双基因共表达载体,并检测其在树突状细胞(DC)中的表达。方法以plambd-Der p2为模板扩增Der p2基因,双酶切pIRES2EGFP和Der p2基因,将Der p2基因克隆入pIRES2EGFP得pIRES2EGFP-Der p2。双酶切pMD18T-FasL质粒获得FasL片段,克隆入pIRES2EGFP-Der p2,获得FasL和Der p2共表达重组载体pIRES2EGFP-FasL-Der p2,采用酶切及测序鉴定重组质粒。将重组质粒转染DC,采用RT-PCR和Western Blot法检测FasL和Der p2基因的mRNA及蛋白水平的表达。结果测序证实FasL和Der p2基因序列完全正确。重组质粒转染DC后,能表达FasL和Der p2的mRNA和蛋白。结论成功构建FasL和Der p2双基因共表达重组载体pIRES2EGFP-FasL-Der p2,转染DC后能在体外正确表达FasL和Der p2基因。

肺脏树突状细胞表面共刺激分子在小鼠哮喘模型中的表达

目的通过检测哮喘小鼠肺组织中树突状细胞(dendritic cells,DC)表面共刺激分子的表达以及细胞因子分泌的能力,探讨哮喘发生免疫耐受缺陷的原因。方法Balb/c小鼠60只,分为3组(每组20只):哮喘组、磷酸盐缓冲液(PBS)对照组、健康对照组。对3组小鼠取肺组织做病理观察,行支气管肺泡灌洗液(BALF)计数细胞并分类,ELISA检测血清特异性IgE(sIgE)及BALF中细胞因子的水平。分离、培养肺脏DC,用流式细胞仪(FACS)测CD11c表达,并进一步用FACS分析哮喘小鼠DC表面共刺激分子CD11cCD80、CD11cCD86表达的变化。结果哮喘小鼠肺组织表现为以嗜酸性粒细胞、淋巴细胞浸润为主的炎症改变,BALF中嗜酸性粒细胞计数显著增加(P<0.01),血清sIgE水平显著升高(P<0.01)。与PBS对照组比较,哮喘小鼠CD11cCD80、CD11cCD86表达上调(P<0.01),其分泌IL-10细胞因子的水平明显下降。结论肺脏DC可能通过上调CD11cCD80、CD11cCD86在哮喘的免疫耐受缺陷中发挥作用。

屋尘螨致敏/激发小鼠气道变态反应性炎症模型的构建

目的使用屋尘螨(HDM)提取液致敏和激发C57BL/6小鼠构建气道变态反应性炎症模型的方法。方法模型组和对照组,各8只。模型组以HDM致敏和激发小鼠,分别于第0、7、14、21天腹腔注射HDM,10 d后,连续雾化吸入HDM 3 d。对照组以PBS代替HDM。进行支气管肺泡灌洗液(BALF)细胞总数计数和分类计数,肺组织病理检查,ELISA测定BALF上清中IL-4、IL-5和IFNγ-水平。结果模型组可见明显炎性细胞浸润,以嗜酸性粒细胞为主。而对照组未见明显炎性细胞浸润。BALF中细胞总数计数和嗜酸性粒细胞比例较对照组明显升高(P<0.01);BALF上清中IL-4、IL-5水平较对照组明显升高(P<0.001),IFNγ-水平较对照组降低(P<0.01)。结论使用HDM致敏和激发C57BL/6小鼠成功地建立了小鼠气道变应性炎症模型。

脂多糖刺激对1,25-二羟维生素D_3处理的树突状细胞表型及功能的影响

目的研究脂多糖(LPS)刺激对1,25-二羟维生素D3处理的树突状细胞表型及功能的影响。方法 10-8mol/L 1,25-二羟维生素D3处理的不成熟树突状细胞经LPS刺激活化24 h,倒置显微镜观察其形态学,流式细胞仪检测其表面共刺激分子CD80、CD86、CD40及MHCⅡ表达,ELISA方法检测其分泌IL-12p70及IL-10水平,混合淋巴细胞反应法测定其刺激同种异体T细胞增殖的能力。结果脂多糖刺激1,25-二羟维生素D3处理的树突状细胞形态类似于不成熟DC形态,表面共刺激分子CD86及MHCⅡ高表达,抑制IL-12p70分泌,促进IL-10分泌,抑制同种异体CD4+T细胞增殖。结论 1,25-二羟维生素D3处理的树突状细胞显示了耐受性树突状细胞特性,能抑制脂多糖驱动的CD4+T细胞增殖,这为研究1,25-二羟维生素D3处理的树突状细胞诱导免疫耐受治疗哮喘等自身免疫性疾病奠定了基础。

肺动脉平滑肌细胞对低氧诱导的肺微血管内皮细胞白介素表达的调节及机制

目的研究低氧对肺微血管内皮细胞(PMVECs)的白细胞介素(IL)6、IL-1β、受体酪氨酸激酶(RTK)和Janus激酶3(JAK3)表达的影响,以及肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)在其中的调控作用。方法单独培养的大鼠PMVECs分为正常(N)组及低氧2h(H2)组、6h(H6)组、12h(H12)组,另设立PMVECs共培养组(与PASMCs共同培养)和单纯培养组,均接受6h或12h的低氧(氧浓度为3%)处理。应用RT-PCR方法检测IL-6、JAK3的mRNA表达水平,放免法测定培养细胞上清中的IL-6蛋白含量,放射性酶分析法测定细胞膜、胞质中RTK的活性,ELISA法测定细胞培养上清中的IL-1β蛋白含量。结果低氧刺激后,PMVECs的IL-6、JAK3mRNA表达及IL-6、IL-1β蛋白含量均增加。与N组比较,低氧处理各组的以上各指标均有所上升(P<0.01),以6h时间点最为明显(P<0.01)。胞膜RTK活性在低氧刺激各组明显降低(P<0.01),而胞质RTK活性明显升高(P<0.01),以12h时间点最为明显(P<0.05)。在低氧刺激6h后,共培养组的PMVECs内IL-6、JAK3的mRNA表达,以及IL-6、IL-1β蛋白含量均较单纯培养组有所降低(P<0.05);在低氧刺激12h后,共培养组的PMVECs的RTK活性也较单纯培养组降低(P<0.05)。结论低氧可以促进PM-VECs的IL-6mRNA表达,并能增加IL-6和IL-1β蛋白含量,复合培养情况下PASMCs对此具有下调作用,其机制可能与RTK和JAK涉及的信号转导通路有关。

FasL基因和屋尘螨过敏原基因共表达质粒DNA疫苗对屋尘螨致敏/激发小鼠气道炎症的作用

目的:观察FasL基因和屋尘螨过敏原Derp2基因共表达质粒的DNA疫苗(DNA-FasL-Derp2)对屋尘螨致敏/激发小鼠气道炎症的作用。方法:DNA-FasL-Derp2肌注接种屋尘螨致敏/激发C57BL/6小鼠,再次激发后处死小鼠。观察肺组织病理变化,检测支气管肺泡灌洗液(BALF)细胞总数和分类计数,以及IL-5、IFN-γ水平。并与仅编码Derp2基因的DNA疫苗(DNA-Derp2)比较。结果:接种DNA-FasL-Derp2和DNA-Derp2均能显著减轻屋尘螨致敏/激发小鼠气道炎症,减少BALF中细胞总数和嗜酸粒细胞比例,降低BALF中IL-5水平,以DNA-FasL-Derp2更显著。结论:DNA-FasL-Derp2可有效抑制屋尘螨致敏/激发小鼠气道炎症,而且比DNA-Derp2更有效。

巨噬细胞炎症蛋白-2在内毒素性急性肺损伤中的作用

目的：探讨巨噬细胞炎症蛋白２（ＭＩＰ２）在内毒素性急性肺损伤（ＡＬＩ）中的可能作用。方法：采用斑点杂交及原位杂交技术对ＡＬＩ大鼠肺组织中ＭＩＰ２ｍＲＮＡ的表达进行定量和定位研究。结果：内毒素性ＡＬＩ时大鼠各时点肺组织ＭＩＰ２ｍＲＮＡ表达量显著高于对照组，且与血浆及肺组织匀浆髓过氧化酶（ＭＰＯ）活性呈正相关（ｒ＝０．７２９，０．８８５，Ｐ均＜０．０５）。原位杂交发现，在ＡＬＩ早期，肺内巨噬细胞是ＭＩＰ２的主要分泌细胞。结论：在ＡＬＩ早期，巨噬细胞释放的ＭＩＰ２可能是ＡＬＩ时多形核白细胞（ＰＭＮ）在肺内大量浸润并激活的原因之一。

Rab1对海水干预肺微血管内皮细胞β肾上腺素受体表达的调节作用

目的研究Rab1对大鼠肺微血管内皮细胞(RPMVECs)β肾上腺素受体(β-ARs)表达的调节作用。方法取原代培养的RPMVECs作为研究对象,设计3个实验:(1)检测海水干预对β-ARs表达的影响,设对照组和海水处理(SW)组。(2)构建大鼠野生型Rab1慢病毒表达载体(Rab1WT)和Rab1阴性突变体慢病毒表达载体(Rab1N124I),检测两种质粒转染对β-ARs及其亚型(β1-AR、β2-AR)表达的影响,设对照组、转染Rab1WT组(WT组)和转染Rab1N124I组(N124I组)。(3)检测Rab1WT转染对海水处理β-ARs表达的影响,设对照组、SW组和转染Rab1WT后海水处理组(WT/SW组)。上述3个实验中,对照组RPMVECs常规培养至实验结束;SW组细胞常规培养后用海水处理2h;WT组和N124I组细胞分别转染Rab1WT和Rab1N124I(滴度109TU/ml);WT/SW组细胞转染Rab1WT后培养48h,用海水处理2h。β-ARs及其亚型的表达均采用配体饱和测定法进行检测。结果 (1)对照组和SW组RPMVECs表面β-ARs的表达量分别为2107.00±202.36和1324.00±130.01cpm/105细胞,差异有统计学意义(P<0.01)。(2)对照组、WT组和N124I组β-ARs的表达量分别为2048.00±207.64、2833.00±203.07和1040.00±91.59cpm/105细胞(P<0.05),β1-AR分别为517.78±29.65、591.22±18.29、364.11±20.68cpm/105细胞(P<0.05),β2-AR分别为1627.90±112.27、2262.10±169.33和694.33±29.79cpm/105细胞(P<0.05)。与对照组比较,WT组β1-AR的表达增加了14.2%(P<0.05),β2-AR增加了49.0%(P<0.01)。(3)SW组β-ARs的表达量为1276.00±121.42cpm/105细胞,与对照组(2059.00±174.62cpm/105细胞)比较下降了38.0%(P<0.01),WT/SW组β-ARs的表达量为2017.20±101.14cpm/105细胞,与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05),与SW组比较增加了58%(P<0.01)。结论海水干预可降低β-ARs在RPMVECs细胞膜上的表达,Rab1可对抗该作用,使β-ARs的表达上调。