脑源性神经生长因子促进骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的实验研究

目的探索脑源性神经生长因子(BDNF)在诱导骨髓间充质干细胞(BMSCs)分化为神经元样细胞过程中的作用。方法应用Ficoll分离骨髓中单核细胞,贴壁培养细胞,观测形态并用流式细胞仪检测其细胞表面标志;用含β-巯基乙醇(BME)、BDNF及碱性成纤维细胞因子(bFGF)的条件培养基使培养的细胞向神经细胞诱导分化;采用免疫荧光染色法对分化的细胞进行鉴定。结果分离培养的贴壁细胞具有典型的BMSCs的形态和细胞表面标志,诱导后细胞表达神经元和星型胶质细胞标志神经元特异性烯醇化酶(NSE)、和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)。结论BMSCs在体外具有分化为神经元样细胞的能力,BDNF具有促进分化的作用。

人骨髓基质细胞向神经细胞分化的方法学研究

目的改进采用人骨髓体外培养人骨髓基质细胞(hBMSCs),进行体外传代扩增,并探索体外诱导分化为神经元样细胞的方法.方法抽取人骨髓血,淋巴细胞分离液分离,DMEM/15%人血清培养传代,至第3～5代时加入巯基乙醇(BME),观察hBMSCs分化为神经元样细胞的形态学变化.结果该方法hBMSCs在体外可以实现数目扩增,在特定诱导剂的作用下向神经元样细胞分化.结论采用少量骨髓样本,既可培养获得充足的细胞量,可以满足定向诱导和细胞移植的需要.

内皮抑素基因转移对乳腺癌细胞生长影响的体内和离体研究

目的探讨内皮抑素(ES)基因转移在乳腺癌抗血管新生中的作用。方法通过建立逆转录病毒介导的ES基因转移系统,用ES病毒转染人乳腺癌细胞系MDA-MB-231。以聚合酶链反应(PCR)、MTT法和裸鼠成瘤实验分析ES的生物学特性及其功能。结果脂质体转染与交互感染策略获得ES病毒生产细胞;以ES病毒转染MDA-MB-231细胞后,经PCR分析显示其内有ES基因整合并持续表达,其分泌的ES能明显抑制内皮细胞EA.hy926的增殖(P<0.05),但对肿瘤细胞的离体生长无明显影响(P>0.05);裸鼠皮下移植瘤模型表明,ES基因表达可明显抑制MDA-MB-231细胞的生长(P<0.01);实验组的肿瘤微血管密度(MVD)和血管内皮生长因子(VEGF)表达低于对照组(P<0.05)。结论逆转录病毒载体介导的ES基因在乳腺癌细胞中可有效表达,能明显抑制血管内皮细胞生长,并通过旁分泌方式抑制血管新生,具有显著的抗肿瘤生长的作用。

丝素膜血液相容性研究

目的 了解丝素膜的血液相容性。方法 将致密丝素膜、多孔丝素膜和对照组的牛心包、蚀原海绵行复钙试验、溶血试验、血小板粘附试验。结果 复钙时间 :致密丝素膜较多孔丝素膜、牛心包、蚀原海绵延长 ,致密丝素膜与后三者之间有显著性差异 (P <0 0 1 ) ,后三者之间无显著性差异。溶血率 :致密丝素膜 3 2 8% ,多孔丝素膜2 0 2 % ,牛心包 0 1 9% ,蚀原海绵 0 2 8% ,均小于 5 % ,均不引起溶血。血小板粘附试验 :四种材料表面血小板均没有明显变形 ,致密丝素膜表面粘附的血小板较其余三种材料少。结论 丝素膜具有良好的血液相容性。

基因转移FasL诱导人黑色素瘤细胞凋亡的体外研究

目的:探讨体外基因转移Fas配体(Fas-Ligand,FasL)对恶性人黑色素瘤细胞凋亡的影响。方法:用携带人FasLcDNA的缺陷型重组腺病毒载体(Ad-FL),在体外转导2株黑色素瘤细胞,并使其表达;通过流式细胞仪、RT-PCR法进行Fas/FasL表达检测,TUNEL法及荧光显微镜检测细胞凋亡状况。结果:流式细胞仪和RT-PCR检测两株黑色素瘤细胞表面均表达Fas,不表达FasL,而Ad-FL转导的两株黑色素瘤细胞均能表达FasL;Ad-FL能显著诱导两株黑色素瘤细胞在体外凋亡或抑制其生长。结论:重组腺病毒FasL在体外诱导人黑色素瘤细胞凋亡效果显著。

血管内皮抑素转基因口服制剂联合5-Fu、IFN-α 2a治疗结肠癌的实验研究

目的探讨血管内皮抑素转基因双歧杆菌口服制剂(ETB-2,E)联合5-Fu(F)、IFNα-2a(I)对裸鼠结肠癌的治疗效应,并探讨其作用机制。方法将人结肠癌细胞LoVo接种于BALB/c裸鼠皮下建立动物模型,随机分为6组,每组6只动物,除对照组用等量生理盐水灌胃外,余分别给予E、F、I、E+F、E+I等药物。6组均于接种后第22天处死动物,计算抑瘤率。观察病理变化,用免疫组化法检测微血管密度(MVD)、增殖细胞核抗原指数(PCNA指数)和血管内皮生长因子(VEGF)阳性率,用RT-PCR法检测VEGF mRNA、TGFβ-1mRNA,用DNA原位末端标记(TUNEL)法检测凋亡率。结果(1)对照组抑瘤率为0,E组、F组、I组、E+F组、E+I组抑瘤率分别为47.26%、60.69%、34.68%、71.23%、63.09%,E+F组、E+I组抑瘤率分别与E组、I组相比,差异有显著性(P<0.05)。(2)E+F组和E+I组MVD与对照组相比,差异有显著性(P<0.05);E+F组、E+I组VEGF阳性率分别与对照组、F组相比,差异有显著性(P<0.05);PCNA指数各治疗组有降低趋势,但各组间比较,差异无显著性(P>0.05)。(3)E+F组、E+I组VEGF mRNA、TGFβ-1mRNA较对照组、E组、F组、I组明显降低(P<0.05)。(4)E组、I组、E+F组、E+I组凋亡率与对照组相比,差异均有显著性(P<0.05)。(5)常规病理检查发现,E组血管明显减少,E+F组和E+I组则坏死较为严重,血管明显减少。结论ETB-2分别联合5-Fu、IFN-α2a可更有效地抑制裸鼠结肠癌的生长,具有协同作用。

蛛网膜下腔出血大鼠血清VEGF表达水平变化与脑水肿的相关性研究

目的探讨大鼠蛛网膜下腔出血（SAH）后血清VEGF水平的动态变化与脑水肿的相关性，观察大鼠SAH后早期阻断VEGF的作用是否能减轻脑水肿。方法将72只Sprague—Dawley大鼠随机分为3组，假手术组枕大池注入09％氯化钠注射液，模型组采用枕大池二次注血法制作SAH模型，干预组在制作SAH模型的同时通过枕大池注入抗VEGF多克隆抗体。于SAH（或注射0．9％氯化钠注射液）后第1、3、5、7天时抽取静脉血．离心获取血清，并处死动物。取海马区大脑组织行病理学检测，其余脑组织采用脑湿、干重比率法测定脑组织含水量。采用ELISA法检测大鼠血清VEGF水平，分析大鼠血清VEGF水平和脑组织含水量的相关性。结果模型组大鼠血清VEGF水平和脑组织含水量第1天即开始升高，第3天达到顶峰，第5天后开始下降，均明显高于假手术组（P〈0.05或001），血清VEGF水平和脑组织含水量之间呈直线相关关系（r=0564，P〈0．01）。枕大池注射抗VEGF抗体治疗的干预组大鼠血清VEGF水平变化与模型组相似，但脑组织含水量仅在第3、5天时明显升高，且各时点均较模型组明显为低（P〈0．05或O．01）。结论VEGF在SAH后脑水肿中起重要促进作用，SAH后早期应用VEGF拮抗剂可缓解脑水肿。

多形性胶质母细胞瘤的硼中子俘获治疗研究进展

硼中子俘获治疗(Boron neutron capture therapy,BNCT)是一种理论上即使当肿瘤细胞已经扩散到正常组织中仍可以选择性杀伤肿瘤细胞而不损伤正常组织的治疗方法。这种肿瘤细胞选择性放射治疗依赖于同位素硼(10B)和热中子,通过硼中子俘获反应释放α粒子和7Li粒子,产生9μm有限长度的杀伤距离。BNCT研究进展缓慢因为缺乏新的硼携带制剂,目前应用较多的对二羟基苯丙氨酸硼(boronophenylalanine,BPA)和巯基硼烷(sodium borocaptate,BSH)还没有明确的最佳给药剂量和给药方式。另外一个主要问题是对中子核反应堆的依赖性。最近的的临床研究主要集中于高级别的胶质瘤和皮肤黑色素瘤的治疗。迄今为止全球已有350多例高级别胶质瘤的患者接受了这种方式治疗。将来不断进步的肿瘤靶向硼化合物研究、给药方式、硼制剂携带系统、医院中子源及医院内联合治疗方式的发展必将提高BNCT的疗效。

骨癌痛大鼠脊髓背角KCC2的表达及可能机制

目的研究骨癌痛大鼠脊髓背角钾离子-氯离子联合转运体2(potassium-chloride cotransporter2,KCC2)的表达变化及其可能机制。方法采用大鼠胫骨骨髓腔接种Walker256肿瘤细胞建立胫骨癌痛模型。观测种瘤前后大鼠机械缩足反射阈值(mechanical withdrawl thresthold,MWT)和脊髓背角KCC2表达水平的变化,观察痛敏形成前鞘内预注射酪氨酸蛋白激酶B(tyrosine protein kinase B,TrkB)中和抗体阻断脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BD-NF)-TrkB途径对KCC2表达和机械性痛觉超敏的影响。结果大鼠种瘤后6～12d,MWT明显下降(P<0.01),出现明显的机械性痛敏,脊髓背角KCC2蛋白水平进行性降低(P<0.01);鞘内预注射TrkB中和抗体的骨癌痛大鼠,其脊髓KCC2表达水平和MWT明显高于注射IgG和不作处理的骨癌痛大鼠(P<0.01)。结论脊髓背角的KCC2可能参与了骨癌痛的发生发展,而BDNF-TrkB途径可能介导了该作用。

塞来昔布对实验性结肠癌原位移植瘤生长及血管形成的影响

目的:探讨塞来昔布对实验性结肠癌原位移植瘤生长及血管形成的影响。方法:使用对数生长期的人结肠癌细胞(HT-29)于裸鼠皮下接种成瘤后原位种植。术后随机分为对照组(C组)及塞来昔布高、中、低剂量组(H、M、L组)共四组进行研究。结果:24只裸鼠实验期间无1只死亡,成瘤率为100%,比较各组原位移植瘤体积和瘤质量差异有统计学意义,P值均<0·05。L、M和H组的抑瘤率分别为25·30%、38·80%和76·92%,与对照组比较差异有统计学意义,P=0·000,且存在明显的剂量依赖。干预组瘤组织中MVD、VEGFmRNA、MMP-2mRNA和匀浆上清中PGE2含量与对照组相比差异有统计学意义,P值分别为0·050、0·050、0·050和0·010,随着剂量增加,MVD、VEGFmRNA、MMP-2mRNA和匀浆上清中PGE2含量逐渐降低。瘤组织中PGE2含量与瘤质量,以及MVD与VEGFmRNA、MMP-2mRNA均存在显著的正相关性,r=0·8814,P=0·000;r=0·8573,P=0·000;r=0·6427,P=0·001。结论:塞来昔布通过抑制人结肠癌裸鼠原位移植瘤环氧化酶-2活性,抑制PGE2合成、VEGFmRNA和MMP-2mRNA表达,抑制肿瘤的血管形成,从而对结肠癌的生长有抑制作用。

沉默乏氧诱导因子-1α和生存素基因联合放疗对裸鼠移植人肝癌的抑瘤效应

为探讨RNA干扰(RNA interference,RNAi)乏氧诱导因子-1α(Hypoxia induced factor1α,HIF-1α)和生存素(Survivin)基因联合X射线照射对裸鼠移植人肝癌细胞SMMC-7721的抑瘤效应,肿瘤局部注射脂质体包裹的靶向HIF-1α和/或Survivin基因的RNA干扰质粒后,接受5Gy X射线照射。观察各组裸鼠治疗后不同时间肿瘤体积和平均存活时间,以免疫组化染色法检测肿瘤组织Survivin、HIF-1α、增殖细胞核抗原(Proliferation cell nuclear antigen,PCNA)表达和肿瘤间质微血管密度,以TUNEL法检测肝癌细胞凋亡。结果表明,治疗开始后第9-21天,双干扰联合放疗组裸鼠肿瘤体积显著小于单干扰联合放疗组,且平均生存时间明显延长。治疗结束后1天,双干扰联合放疗组裸鼠肿瘤组织Survivin、HIF-1α、PCNA表达和肿瘤间质微血管密度明显低于对照组和放疗组,双干扰联合放疗组移植瘤凋亡细胞百分数较其它组明显升高。结果提示,双干扰联合放疗可有效地抑制裸鼠移植人肝癌细胞增殖和血管生成,促进细胞凋亡,其抑瘤效应明显优于放疗和单干扰联合放疗。

大鼠鞘内注射MCP-1中和抗体缓解骨癌痛

目的观察脊髓趋化因子单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1,MCP-1,或CCL2)在骨癌痛大鼠中的可能作用。方法大鼠胫骨骨髓腔接种Walker256肿瘤细胞建立骨癌痛模型。观测造模前、后大鼠机械性痛觉超敏Von Frey阈值并观察造模后d 10～12,鞘内给予MCP-1中和抗体对大鼠Von Frey阈值和脊髓小胶质细胞激活标志物(ox-42)表达的影响。结果大鼠种瘤后6～12 d,机械性痛觉超敏Von Frey阈值进行性下降(P<0.01);与对照组相比,鞘内给予MCP-1中和抗体后,脊髓ox-42的表达水平明显降低(P<0.01),Von Frey阈值的明显升高(P<0.01)。结论大鼠鞘内注射MCP-1中和抗体缓解骨癌痛,其机制可能与抑制小胶质细胞的激活相关。

红细胞压积对血液粘度与相对粘度的作用比较

血管中血液一般以层状移动方式流动,血浆的层流状态随其中的血细胞含量增多而逐渐被扰乱。相对粘度（relative viscosity,RV）,即血液粘度（Blood viscosity,BV）与血浆粘度（plasma viscosity,PV）的比值,可被用于评估红细胞扰乱血浆层流状态的程度。红细胞压积（Hematocrit,Hct）是血液粘度的主要决定因素。本文对Hct同BV与RV的相关性及对其变化的作用作如下分析比较。

针对小胶质细胞上BDNF表达的siRNA筛选及其抑制效应检测

目的筛选有效抑制小胶质细胞上脑源性神经生长因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)表达的小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)序列,并观察其对小胶质细胞活性标记物OX-42表达的调节作用。方法设计并合成针对BDNF的siRNA3对(siRNA1588,siRNA283,siR-NA232)及一条带绿色荧光标记的通用阴性对照FAM-siRNA。在LipofectamineTM 2000介导下转染小胶质细胞。分别采用Real-TimePCR及Western blot方法测定并比较其抑制率;采用磺基罗丹明B法(sulforhodamine B,SRB)分析转染复合物的细胞毒性。同时采用免疫荧光组织化学结合共聚焦显微镜观察BDNF和OX-42的表达情况。结果①与阴性对照组及siRNA283、siRNA232相比,BDNFsiRNA1588(50μmol·L-1,脂质体与siRNA比例1∶3)干扰小胶质细胞后,其mR-NA和蛋白的相对表达量最低(P<0.01)。②Lipofectami-neTM 20008μl复合50μmol·L-1siRNA(脂质体与siRNA比例为1∶3),不仅细胞毒性低而且转染效率高(P<0.01),为最佳转染条件。③BNDF和OX-42存在共表达;且siR-NA1588作用后OX-42的平均光密度值(IOD/area)明显降低(P<0.01)。结论①siRNA1588对小胶质细胞上BDNF表达的抑制效果最大。②BDNF在小胶质细胞的活性调节中具有重要作用。

塞来昔布联合5-Fu对人结肠癌裸鼠皮下移植瘤生长的影响

目的探讨选择性环氧化酶-2(Cyclooxygenase-2,Cox-2)抑制剂-塞来昔布(celecoxib)联合5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-Fu)对实验性人结肠癌裸鼠皮下移植瘤生长的影响及作用机制。方法建立人结肠癌裸鼠皮下移植瘤模型,模型建立后32只实验裸鼠随机分为四组,分别给予塞来昔布及5-Fu药物干预后观察各组皮下移植瘤体积、瘤重和裸鼠实验前后的体重变化,计算抑瘤率。电镜观察细胞凋亡形态,原位凋亡染色检测凋亡指数(AI),免疫组化及Western blot印迹法检测细胞色素C、caspase-3及caspase-9表达。结果塞来昔布干预组、5-Fu干预组和联合干预组肿瘤生长明显抑制,塞来昔布干预组、5-Fu干预组抑瘤率分别为27.81%和53.02%,联合干预组抑瘤率为78.37%(P<0.01)。干预组较对照组肿瘤细胞凋亡明显增加,干预组各组之间凋亡指数比较差异有统计学意义(P<0.01)。透射电镜下见干预组瘤细胞呈现明显凋亡形态改变,联合干预组凋亡表现尤为典型,对照组无明显凋亡形态改变。免疫组化及Westernblot印迹法显示干预组其细胞色素C、caspase-3及caspase-9的表达明显高于对照组,且干预组各组之间比较其表达差异也有统计学意义(P<0.05)。结论塞来昔布及5-Fu均具有明显的抗肿瘤作用,联合应用时具有协同作用,可显著抑制人结肠癌裸鼠皮下移植瘤的生长,其作用机制可能与上调细胞色素C、caspase-3及caspase-9蛋白表达、激活细胞色素C依赖性凋亡信号通路有关。

人结肠癌裸鼠原位移植瘤模型的建立

目的 建立人结肠癌裸鼠原位移植瘤模型。方法 使用对数生长期的人结肠癌细胞(HT- 2 9)在裸鼠皮下接种4周形成稳定的皮下移植瘤,再将皮下移植瘤组织块原位接种于2 4只裸鼠盲肠浆膜下,以完成原位移植瘤模型的制备。术后随机分四组,对照组(C组)、塞来昔布(celecoxib)高、中、低剂量组(H、M、L组) ,分别给予纯水及含有不同浓度(15 0 0 ppm、10 0 0ppm和5 0 0 ppm)的塞来昔布的饮水,饲养4 2d后处死裸鼠,观察各组原位移植瘤的成瘤率、瘤体积、重量以及裸鼠实验前后的体重变化,计算抑瘤率。结果 2 4只裸鼠实验期间无一只死亡,成瘤率为10 0 % ,荷瘤鼠实验前后体重变化比较在统计学上无显著差异(P >0 .0 5 ) ,各组原位移植瘤体积P <0 .0 5和瘤重P <0 .0 1比较差异有显著性,L组、M组和H组的抑瘤率分别为2 5 .30 %、38.80 %、76 .92 % ,与对照组比较差异有显著性(P <0 .0 5 )。结论 本实验成功建立了人结肠癌裸鼠原位移植瘤模型,为研究人结肠癌发病机制和干预策略提供了较为理想的动物模型,塞来昔布对人结肠癌原位移植瘤生长具有明显的抑制作用,且有一定的量效关系。

脑肿瘤放疗甲壁微循环变化探讨

目的 探讨脑肿瘤及经术后放疗的脑肿瘤患者的甲壁微循环变化。方法 应用PCV-3C型微循环测定仪对50例脑肿瘤病人及经术后放疗的脑肿瘤患者，40例健康成人作甲壁微循环测定。结果 肿瘤组，放疗组的四项积分值，明显高于健康人组；肿瘤组与放疗组比较，流态积分差别非常显著。结论 甲壁微循环检测对肿瘤病人的诊断有一定的参考价值，一定量的辐射，即常规量的放疗，可以使肿瘤患者的甲壁微循环出现向好的倾向，机体出现良性恢复，有助于疗效的判断。

miR-210反义慢病毒对乏氧人肝癌细胞放射敏感性的影响

为探讨miR-210表达下调对乏氧人肝癌SMMC-7721细胞放射敏感性的影响,利用分子生物学技术构建miR-210反义和随机寡核苷酸慢病毒载体,经慢病毒转染建立稳定转染miR-210反义和随机寡核苷酸的人肝癌SMMC-7721细胞株。以实时定量RT-PCR检测乏氧SMMC-7721细胞HIF-1αmRNA表达和miR-210表达,以四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞增殖活性,流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡,克隆存活实验检测细胞放射敏感性变化。结果表明:SMMC-7721细胞乏氧培养后,HIF-1α和miR-210表达随时间逐渐增加,稳定转染miR-210反义寡核苷酸能明显下调miR-210在乏氧细胞的表达;下调miR-210表达明显抑制乏氧SMMC-7721细胞体外增殖活性(P<0.05;P<0.01),诱导G1期阻滞(P<0.05),促进细胞凋亡(P<0.01),提高乏氧SMMC-7721细胞放射敏感性,放射增敏比约为1.21。结果提示,下调miR-210表达可抑制乏氧SMMC-7721细胞体外增殖,诱导凋亡,增强其放射敏感性。

用于临床标本的无细胞非同源末端连接检测体系的建立

目的 建立一个用于临床标本的体外非同源末端连接的检测体系。方法 从白血病细胞株和正常骨髓及外周血细胞中提取的核蛋白在体外与线性质粒pUC18DNA一起作用,通过琼脂糖凝胶电泳分离和SYBRgreenⅠ染色观察其连接能力。结果 白血病细胞株NB4、U937、K5 6 2、SHI 1、Jurkat的连接能力为10 .6 %～32 .9% ,正常骨髓或外周血细胞的连接能力为5 .2 %～2 0 .0 %。结论 无细胞的非同源末端连接检测体系的建立是研究人类白血病细胞DNA修复机制的实验基础。

血浆置换联合乳果糖治疗重症肝炎对血浆氨基酸谱变化的影响

目的 明确重症肝炎氨基酸谱变化的特点 ,探讨血浆置换 (PE)及血浆置换联合乳果糖治疗对其的影响。方法 检测血浆置换及其联合乳果糖治疗的重症肝炎患者各 2 0例 ,分析其氨基酸谱变化特点及氨基酸变化与PTA改善的关系。结果 重症肝炎患者血清蛋氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸浓度显著增高 ,亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸浓度和BCAA/AAA比值显著下降 (均P <0 .0 1) ;PE及PE联合乳果糖治疗组芳香族氨基酸浓度下降 ,支链氨基酸浓度升高 ,BCAA/AAA比值上升 (P <0 .0 5 ) ,联合组与单纯PE组比较有显著差异 (P <0 .0 5 ) ;治疗组BCAA上升值、AAA下降值与PTA增加值呈正相关。结论 重症肝炎患者存在特征性氨基酸谱改变 ,尤以BCAA/AAA比值的改变与肝功能改善显著相关 ,PE治疗能调整氨基酸代谢 ,改善患者肝脏功能 ,联合应用乳果糖可以提高疗效。