肾移植受者并发巨细胞病毒感染的临床实验研究

目的 :探讨肾移植受者并发巨细胞病毒 (Cytomegalovirus ,CMV)感染后实验指标的变化及各指标的相关性 ,为诊断CMV感染及预防CMV病发作提供依据。方法 :运用Real TimePCR及流式细胞分析法等技术对肾移植受者的标本进行检测。结果 :(1)肾移植术后 14周内 ,尿液、血浆及白细胞中CMV DNA阳性检出率分别为 73 5 %、79 4 %及85 3% ;肾移植术后 18周内 ,尿液、血浆及白细胞中CMV DNA阳性检出率分别为 82 1%、85 7%及 85 7% ;(2 )肾移植术后 8周内 ,血浆及白细胞中CMV DNA的载量随术后时间的延长而增加 ;尿液中CMV DNA的载量在术后 12周内随时间的延长而波动性增加 ;(3)尿液、血浆及白细胞内CMV DNA检出率的峰值分别出现在肾移植术后第 12周、第 8周内及第 8周时 ;(4 )肾移植术后第 8周时 ,尿液中CMV DNA载量与CD3+ T淋巴细胞 (P =0 0 0 2 0 )、CD4 + T淋巴细胞 (P=0 0 0 19)、CD5 6 + T淋巴细胞 (P =0 0 2 35 )及血清肌酐 (P =0 0 2 5 3)的相关性具有统计学意义 ,而与CD8+ T淋巴细胞、丙氨酸转移酶、谷草转氨酶、血清尿素氮等的相关性无统计学意义 (P >0 0 5 ) ;血浆及白细胞中CMV DNA载量均只与丙氨酸转移酶的相关性有统计学意义 (P <0 0 0 1) ;结论 :(1)Real

初发2型糖尿病患者血清25-羟维生素D水平及相关性研究

目的:比较初发2型糖尿病患者(T2DM)血清维生素D、人体参数、生化指标与正常对照组的差异,分析维生素D与人体参数、生化指标的相关性,探讨维生素D在早期2型糖尿病发生中的作用及意义。方法:选择初诊T2DM患者65例,同期健康体检者32例,比较两组患者血清25(OH)D水平以及人体参数和生化指标;比较T2DM伴低25(OH)D组和T2DM不伴低25(OH)D组的腰围、BMI、FBS、HbA1C、血压、生化指标及PTH水平。结果:初发T2DM患者血清25(OH)D水平明显低于正常对照组,在维生素D的相关性分析中,25(OH)D与BMI、TG、Apo-A1呈负相关,与HDL-C呈正相关,与血压、血糖、HbA1C无明显的相关性。T2DM患者的PTH水平较对照组明显增高,且与维生素D水平呈负相关。结论:初发T2DM患者的血清维生素D水平较正常对照组降低,尤其是伴有肥胖、血脂异常者的血清维生素D水平降低更明显。但是初发T2DM患者的维生素D水平与血压、空腹血糖、钙离子、糖化血红蛋白无明显相关性。T2DM患者更易并发高血压的原因可能与PTH的增高有关,其机制有待进一步研究。

非小细胞肺癌中基质金属蛋白酶-10的表达

目的:探讨非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)中基质金属蛋白酶-10(matrix metalloprotein-ase-10,MMP-10)的表达及其与临床参数间的关系。方法:使用RT-PCR法及免疫组化法,检测32对NSCLC癌组织及癌旁正常组织中MMP-10的表达水平,并分析其与性别、年龄、分期、分级、肿瘤大小、淋巴结转移及病理类型之间的相关性。结果:MMP-10的表达在mRNA水平与蛋白质水平表达有差异:MMP-10 mRNA在NSCLC癌组织中的表达要显著低于癌旁正常肺组织(P<0.05),MMP-10蛋白在肺癌癌组织中的表达要显著高于癌旁正常肺组织(P<0.01);在NSCLC癌组织中MMP-10 mRNA的表达与MMP-10蛋白的表达呈正相关(r=0.4672,P<0.05),而在癌旁正常肺组织中,两者表达相关性无显著统计学差异(r=-0.003022,P>0.05)。结论:MMP-10 mRNA在肺癌癌组织中表达要低于正常组织,MMP-10蛋白在肺癌癌组织中表达要高于正常组织。

PD-1/PD-L1信号途径在肿瘤免疫逃逸机制中的作用

PD-1/PD-L1作为免疫球蛋白超家族协同刺激分子的重要成员,参与自身免疫、移植免疫以及肿瘤免疫等机体免疫调节过程。PD-1是一个主要表达在活化T细胞上的抑制性受体,与其配体PD-L1结合,可显著抑制T细胞的活化和增殖,并调节细胞因子的表达和分泌。PD-L1则广泛表达在多种免疫细胞、上皮细胞以及肿瘤细胞上。目前诸多研究表明,多种人类肿瘤大量表达的PD-L1分子与患者临床病理特征及预后紧密相关,成为肿瘤检出和预后判断的新的生物学指标。肿瘤细胞通过高表达PD-L1分子,与T细胞上的受体PD-1的结合,传递负性调控信号,导致肿瘤抗原特异性T细胞的诱导凋亡和免疫无能,使肿瘤细胞逃避机体的免疫监控和杀伤。阐明PD-1/PD-L1信号转导机制在肿瘤免疫应答中的作用,并尝试将阻断该信号通路应用于肿瘤免疫治疗,对进一步拓展肿瘤治疗的思路和方法具有重要价值。

肾移植术后RT-PCR动态检测巨细胞病毒尿的临床意义

目的探讨RT-PCR连续动态监测肾移植患者尿中巨细胞病毒（UCMV）载量的临床意义。方法应用RT-PCR技术动态监测56例肾移植患者尿中CMV-DNA载量（术后9周内1周1次,此后2周1次,共23周）。比较CMV肺炎组和非肺炎组在不同时点病毒载量的变化,评价该方法的特异性和敏感性,并探讨高病毒载量与CMV肺炎的相关性。结果56例患者UCMV的阳性率为87.5（49/56）,随访过程中有8例患者出现CMV肺炎,发生率为14.3%,中位发病时间在术后第15周。两组患者在术后4周UCMV-DNA均维持在0值左右,差异无统计学意义（P〉0.05）,而在术后第7、8和11周,CMV肺炎组患者其病毒载量明显高于非肺炎组,差异有统计学意义（P〈0.05）。以术后第5~15周内连续3次病毒载量〉104拷贝/ml作为预测CMV肺炎的指标,其灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为100%、93.6%、61.5%和100%,一致性检验Kappa值为0.7107（95%CI=0.4791-0.9474）,预警时间达2-8周。结论RT-PCR动态监测肾移植患者UCMV-DNA敏感性高,5-15周内病毒载量连续3次〉104拷贝/ml是预测肾移植术后是否发生CMV肺炎的良好指标。

IL-33在人非小细胞肺癌组织中的表达及临床意义

目的研究非小细胞肺癌(NSCLC)患者肿瘤组织和癌旁组织中IL-33的表达情况。方法采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测61例NSCLC患者的肿瘤组织和癌旁组织中IL-33 mRNA的表达水平,再用免疫组织化学染色进一步检测12例不同组织学类型的NSCLC石蜡标本中IL-33的蛋白定位与表达,分析其与肺癌患者临床病理参数、总生存(OS)之间的关系。结果 IL-33 mRNA在肺癌组织中的表达量明显低于癌旁组织,免疫组织化学染色结果表明IL-33蛋白定位于细胞核,并在肺癌组织中低表达。此外,IL-33在肺癌组织中的表达与肺癌病理类型有关,与患者临床病理特征年龄、性别、吸烟史、病理分级和临床分期等均无关;Kaplan-Meier生存曲线分析表明,IL-33 mRNA表达水平与术后生存时间显著正相关。结论 IL-33可能在肺癌的发生发展以及靶向治疗中发挥重要作用。

载脂蛋白M基因rs707921位点多态性与冠心病易感性的关系

目的检测载脂蛋白M(ApoM)基因rs707921位点的基因多态性,探讨其与冠心病(CHD)的相关性。方法采用单荧光标记探针技术检测111例CHD患者及248例对照组的ApoM rs707921位点单核苷酸多态性,分析其基因型和等位基因频率的分布情况。结果 ApoM rs707921位点3种基因型(AA型、AC型和CC型)在CHD组中分布频率为1.8%、13.5%和84.7%,在对照组中分布频率为2.0%、25.4%和72.6%,两组差异有统计学意义(P=0.039);ApoM rs707921位点A、C等位基因的频率在CHD组和对照组中分布频率分别为8.6%、91.4%和14.7%、85.3%,两组比较差异有统计学意义(P=0.023)。CHD组中AC+AA基因型者甘油三酯水平显著低于CC基因型者(P=0.043)。CHD组rs707921位点多态性不同基因型间冠状动脉病变严重程度差异无统计学意义(P>0.05)。结论ApoM基因rs707921位点A等位基因可能降低CHD的发病风险,但与CHD的严重程度无关。

脂蛋白相关磷脂酶A2基因R92H多态性与汉族人群冠心病易感性的关系

目的探讨脂蛋白相关磷脂酶A2基因R92H多态性与冠心病遗传易感性及冠状动脉病变程度的关系。方法采用单荧光标记探针技术检测261例冠心病患者及263例正常人脂蛋白相关磷脂酶A2基因R92H多态性。结果冠心病组RH基因型和H等位基因频率显著高于对照组(P<0.05和<0.01)。RH基因型、H等位基因人群冠心病风险增高(P均<0.01)。Logistic回归分析显示,R92H多态性是冠心病的独立危险因素(P<0.05)。冠心病组中RH和HH基因型者总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇水平高于RR基因型者(P<0.05和<0.01),高密度脂蛋白胆固醇水平显著低于RR基因型者(P<0.05)。冠心病组中,RH和HH基因型者多支血管病变率比RR基因型者明显升高(P<0.05)。结论脂蛋白相关磷脂酶A2基因R92H多态性与中国汉族人群冠心病相关,携带RH、HH基因型人群发生冠心病风险较高,且与更严重的冠状动脉病变有关。

双重荧光实时定量PCR法检测TNF-α mRNA表达水平

目的:建立单管检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和内参GAPDH mRNA表达水平的双重荧光实时定量PCR方法。方法:脂多糖刺激小鼠巨噬细胞Ana-1后提取细胞RNA,经反转录合成c DNA,应用自行设计的不同荧光标记的TNF-α和GAPDH引物探针,经PCR扩增后,在FAM通道和CY5通道分别读取Ct值,同时应用基因测序技术对结果进行验证,并构建质粒标准品分析该方法的灵敏度和重复性。结果:双重荧光实时定量PCR法检测TNF-α的灵敏度达4×101拷贝/μL,检测线性范围可达6个数量级,批内和批间重复性好。结论:新方法消除了目的基因与内参的加样误差,节约成本,快速准确,适用于TNF-αmRNA的定量检测。

常州地区2009年5～10月肠道病毒71型遗传进化初步分析

目的调查常州地区2009年5～10月肠道病毒71型(EV71)种系进化。方法采集患者咽拭子标本,用荧光定量PCR法扩增VP1区序列,基因测序并构建系统发生树。结果 41份咽拭子标本阳性27株(65.9%),挑选5份阳性标本进行PCR克隆测序,CZ02、CZ03、CZ05、CZ06、CZ07 5株病毒与A、B基因型代表株差异较大,核苷酸同源性为86.3%～87.8%;与C1、C2、C3亚型的同源性为90.8%～93.8%,与属于C4亚型的中国大陆深圳株、贵州株、浙江株、重庆株和阜阳株同源性为95.4%～97.7%。结论常州地区2009年5～10月份EV71病毒已测序的5株可定为C4亚型。

肾移植受者外周血循环中pp65阳性内皮细胞的新模式

目的 :为观察感染人类巨细胞病毒 (HumancytomegalovirusHCMV)的 1例女性肾移植受者外周血中膨大内皮细胞 (Cytome galicendothelialcells ,CEC)的一种新模式。方法 :本研究运用了HCMVpp65抗原分析法、实时PCR技术、流式细胞分析法等系列技术。结果 :发现在一围绕并粘附了许多白细胞的蛋白样物质内 ,含有几个pp65阳性的CEC。这种蛋白质样物质的成分和功能目前还不清楚。该患者外周血中出现CEC表明其血管有损伤 ,而且该患者的CD4+ 及CD8+ 淋巴细胞的百分比都超出正常范围。其血浆、外周血白细胞及尿液中的HCMV DNA都阳性 ,但该患者并没有明显的HCMV病症状。结论 :HCMV感染和CEC形成之间的关系需进一步研究。

MCP-1基因多态性与冠状动脉病变程度的关联性研究

目的:探讨苏南地区汉族人群单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)基因-2518A/G单核苷酸多态性与冠状动脉病变程度的关系。方法:采用单荧光标记探针技术检测单核苷酸多态性的方法,检测经冠状动脉造影确诊的297例冠心病患者MCP-1基因-2518A/G多态性位点的基因型和等位基因分布,分析不同冠状动脉狭窄程度人群中MCP-1的基因型和等位基因频率的差异。结果:MCP-1基因-2518A/G单核苷酸多态性的基因型在不同冠状动脉病变程度间的分布差异具有统计学意义(P=0.035),携AG基因型者发生严重冠脉狭窄的相对风险度是携AA基因型者的2.15倍(P=0.029,95%CI1.10～4.22)。结论:苏南地区汉族人群MCP-1-2518位点AA基因型可能有助于保护机体避免发生严重的冠脉狭窄,MCP-1-2518A/G基因多态性可能与冠状动脉病变程度相关。

颈动脉粥样硬化患者MT2A-838G/C和MCP-1-2518G/A基因多态性分析

目的:探讨苏南地区汉族人群MT2A-838G/C和MCP-1-2518G/A基因多态性与颈动脉粥样硬化的相关性。方法:采用碱基淬灭探针技术检测103例有颈动脉斑块患者和46例正常对照的MT2A基因-838位点和MCP-1基因-2518位点基因型分布及基因频率,并评价基因多态性与颈动脉粥样硬化易感性之间的相关性。结果:在对照组和病例组中,MT2A 3种基因型GG、GC、CC的频率分别为52.17%、36.96%、10.87%和50.49%、36.89%、12.62%(P>0.05),等位基因G、C的频率分别为70.65%、29.35%和68.93%、31.07%(P>0.05);MCP-1 3种基因型AA、AG、GC在对照组和病例组中的频率分别为15.22%、52.17%、32.61%和20.39%、44.66%、34.95%(P>0.05),等位基因A、G的频率分别为41.30%、58.70%和42.72%、57.28%(P>0.05)。结论:MT2A-838G/C及MCP-1-2518G/A基因多态性可能不是苏南汉族人群发生颈动脉粥样硬化的独立危险因素。

清醒大鼠高胰岛素-正血糖钳夹技术的建立和应用

目的建立大鼠高胰岛素-正血糖钳夹模型,并探讨短期输注脂肪乳对清醒状态下大鼠葡萄糖输注率(GIR)的影响。方法 SPF级雄性SD大鼠10只,随机数字表法分为2组,每组5只。采用颈动、静脉插管技术,分别经颈静脉给予SD大鼠输注20%脂肪乳(脂肪乳组)和5%葡萄糖6 h(对照组),行高胰岛素-正血糖钳夹实验测定血浆游离脂肪酸(FFA)和GIR。结果与葡萄糖输注的对照组比较,脂肪乳组大鼠输注20%脂肪乳6 h后,血浆FFA水平升高到对照组的17.6倍(P<0.01),GIR下降了27%(P<0.001),胰岛素抵抗非常明显。结论成功建立大鼠高胰岛素-正血糖钳夹技术,给大鼠输注脂肪乳可导致明显的胰岛素抵抗。

大肠癌组织中环氧化酶2基因表达的实时定量PCR检测

目的探讨环氧化酶2(COX-2)在大肠癌发生和发展中的意义。方法建立实时定量RT-PCR方法,采用LightCycler PCR仪检测了28例大肠癌COX-2 mRNA及内参GAPDH mRNA的表达,以COX-2N=(COX-2拷贝数/GAPDH拷贝数)×103表示COX-2 mRNA表达水平。结果肿瘤组织COX-2 mRNA与正常组织表达水平有极明显差异(P<0.05),转移组织较正常组织COX-2mRNA表达有明显差异(P<0.01)。结论COX-2参与了大肠癌的发生和发展,并起到了重要作用。

新疆维吾尔族及哈萨克族冠心病患者肿瘤坏死因子受体2基因多态性研究

目的：研究维吾尔族及哈萨克族人肿瘤坏死因子受体2（tumor necrosis factor receptor2,TNFR2）第6外显子196位点基因多态性与冠心病的相关性。方法：采用病例对照研究的方法,用ShineRoar探针技术检测117名冠心病患者（其中维吾尔族人89名,哈萨克族人28名）以及106名健康体检者（其中维吾尔族人51名,哈萨克族人55名）的TNFR2第6外显子196位点的基因型。结果：维吾尔族冠心病患者与一般人群TNFR2第6外显子196位点等位基因及基因型频率的差异没有统计学意义;哈萨克族TNFR2第6外显子196位点G等位基因携带者发生冠心病的风险明显高于T等位基因携带者（OR=3.560,95%CI：1.157-8.139,χ^2=9.73,P=0.002）;TG或GG基因型携带者发生冠心病的风险明显高于TT基因型携带者。两分类Logistic回归分析结果显示,在控制性别和年龄不变的情况下,哈萨克族TNFR2第6外显子G等位基因与冠心病的发生明显相关（OR=4.100,95%CI：1.315~12.780,χ^2=5.916,P=0.015）。结论：哈萨克族TNFR2第6外显子G等位基因是发生冠心病的主要危险因素之一。

实时荧光定量PCR检测人胰岛素样生长因子及其受体基因的方法学构建

目的建立检测人胰岛素样生长因子1（insulin-like growth factor-1,IGF-1）、IGF-1受体（IGF-1R）、胰岛素样生长因子2（IGF-2）及IGF-2受体（IGF-2R）基因的实时荧光定量PCR。方法设计并合成检测上述4种基因的引物及TaqMan探针;提取胎盘组织RNA并逆转录为cDNA,分别将扩增的4种基因片段纯化后与质粒载体连接,克隆构建含目的基因片段的重组质粒,分别作为定量检测上述4种基因的标准品;用建立的实时荧光定量PCR检测上述4种基因,并用测序验证。结果 PCR扩增产物经测序分析证实分别为上述4种基因的特异性片段;定量检测IGF-1、IGF-1R、IGF-2及IGF-2R的线性范围分别为1.00×10^2-1.00×10^8copies/μL、2.00×10^2-2.00×10^8copies/μL、3.00×10^2-3.00×10^8copies/μL及5.00×10^2-5.00×10^8copies/μL;相关系数（r）分别为0.994、0.993、0.995及0.996;扩增效率分别为92.35%、96.06%、94.92%及98.84%;批间变异系数（CV）分别为1.64%-2.83%、1.73%-1.98%、2.47%-4.09%及2.25%-2.52%;批内CV分别为1.36%、1.02%、1.04%及0.96%。结论建立了高度敏感、特异检测人IGF及其受体的实时荧光定量PCR法。

载脂蛋白M启动子区基因多态性的临床研究进展

载脂蛋白M(apo M)主要存在于高密度脂蛋白中,在脂质和脂蛋白代谢、抗动脉粥样硬化等过程中均发挥着重要作用。研究表明,apo M基因多态性与多种疾病,如冠心病、缺血性脑卒中、糖尿病、类风湿关节炎、慢性阻塞性肺炎、败血症等密切相关。本文就apo M基因启动子区域单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNP)在疾病中的研究进展进行综述。

逆转录-环介导等温扩增快速检测EV71病毒

目的建立一种检测肠道病毒71型(EV71)快速、敏感的一步逆转录-环介导等温扩增(RT-LAMP)方法。方法针对EV71病毒VP2基因特异性序列的6个区域设计4条LAMP引物,建立RT-LAMP检测方法,并评价其特异性和灵敏度。结果通过GoldView染色和凝胶电泳均能观察到LAMP扩增产物的存在,且与柯萨奇病毒A16型(CA16)无交叉反应发生。所建立的RT-LAMP检测方法灵敏,最低检测限为1.0×102copies/mL。RT-LAMP检测的41份咽拭子标本中有27份出现EV71阳性反应,与荧光定量PCR结果一致。结论 RT-LAMP是一种快速、敏感、特异、准确的方法,适合用于基层医疗机构临床检测。