结核分枝杆菌GroEL1蛋白表达、纯化及结构和功能的生物信息学分析

目的:应用基因工程技术和生物信息学方法对结核分枝杆菌GroEL1进行原核表达与纯化及其结构和功能预测,分析该抗原在新型结核疫苗的应用价值。方法:采用PCR技术体外扩增GroEL1基因,并克隆至pET28a质粒中,测序筛选构建成功的pET28a-GroEL1载体,将其载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)表达菌株中,IPTG诱导表达重组GroEL1蛋白,利用镍亲和层析柱纯化。从UniProt数据库中获取H37Ra株GroEL1核苷酸和氨基酸序列;分别运用Protparam、TMHMM-2.0、Protscale、NetChop-3.1、Psortb、SignalP-4.1工具预测GroEL1蛋白的理化性质、跨膜螺旋、亲/疏水性、磷酸化位点、亚细胞定位,信号肽;NetNGlyc-1.0和YinOYang-1.2预测其糖基化位点;SOPMA和Swissmodel预测蛋白的二级结构和三级结构;Clustalw对同源序列进行比对。String预测相互作用蛋白,IEBD和ABCpred预测蛋白的B细胞抗原表位。结果:成功构建重组pET28a-GroEL1载体,GroEL1蛋白在大肠杆菌中部分以可溶形式表达。镍亲和层析柱纯化重组GroEL1蛋白,其纯度达90%以上。Western blot鉴定证实重组GroEL1蛋白具有良好的免疫反应性。结核分枝杆菌H37Ra株GroEL1基因全长1620 bp,编码539个氨基酸,分子量55.88 kD,等电点为4.98,预测显示该蛋白亲水性较强、性质稳定,无跨膜区,有37个可能的磷酸化修饰位点和8个O-糖基化位点,属于非分泌蛋白,定位在细胞质,二级结构显示α-螺旋占53.43%,延伸链占11.87%,β-转角占7.61%,无规则卷曲占27.09%,有多个B细胞抗原表位及多个与GroEL1蛋白相互作用蛋白。结论:成功表达并纯化重组GroEL1蛋白,运用生物信息学成功预测GroEL1蛋白的结构和功能,为结核病的预防、诊断和治疗奠定基础。

结核分枝杆菌耐热抗原(MTB-HAg)对γδ T细胞影响的研究进展

结核分枝杆菌耐热抗原(MTB-HAg)是从结核分枝杆菌(MTB)减毒菌株H37Ra经121℃,20 min,高温高压处理后从菌体释放到上清液中一种多肽类抗原。γδ T细胞是一类广泛分布于非淋巴组织的非常规T细胞,可分泌肿瘤坏死因子α(TNF-α)、γ干扰素(IFN-γ)等细胞因子,在抗MTB感染的免疫应答中发挥重要作用。MTB-HAg可在体外有效刺激γδ T细胞增殖活化,使其更加高效地参与抗结核感染的过程,故MTB-HAg可作为设计新型结核疫苗或药物的潜在靶点。但由于MTB-HAg组成复杂,具体是何种成分刺激γδ T细胞发挥抗MTB感染功能还不清楚。

2,6-二甲氧基-1,4-苯醌通过抑制NLRP3炎症小体活化缓解小鼠的感染性休克

目的 探究发酵小麦胚芽提取物主要活性成分2,6-二甲氧基-1,4-苯醌(DMQ)抑制NLRP3炎症小体活化并缓解小鼠感染性休克的作用机制。方法 细胞学水平:在BMDM细胞中,经脂多糖(LPS)预处理、DMQ干预后,利用尼日利亚菌素(Nigericin)、ATP、尿酸钠结晶(MSU)分别活化经典NLRP3炎症小体以及胞内转染LPS活化非经典NLRP3炎症小体。利用聚脱氧腺苷酸(Poly A:T)活化AIM2炎症小体。在THP-1细胞中,利用Nigericin活化经典NLRP3炎症小体,通过Western blotting和ELISA方法测定NLRP3炎症小体活化产物的表达水平。蛋白分子水平:利用免疫共沉淀探究DMQ阻断NLRP3炎症小体活化的具体机制。动物水平:将8周龄雄性C57BL/6J小鼠随机分为空白对照组、感染性休克LPS组、DMQ 20 mg/kg治疗组、DMQ 40 mg/kg治疗组,6只/组,待DMQ治疗组小鼠预注射相应浓度DMQ后,对照组小鼠注射无菌PBS,其余3组小鼠腹腔注射相同剂量LPS,利用ELISA检测DMQ干预对LPS诱导的小鼠感染性休克模型中血清和腹腔灌洗液中TNF-α和IL-1β分泌水平的影响。DMQ预处理后注射LPS观察记录小鼠36 h内的生存状态并绘制生存曲线。结果 DMQ可有效抑制小鼠BMDM细胞和人THP-1细胞中经典NLRP3炎症小体活化(P<0.05),在小鼠BMDM细胞中对非经典NLRP3炎症小体活化也起到有效抑制作用(P<0.05),DMQ对AIM2炎症小体活化无影响(P>0.05)。进一步实验结果揭示DMQ可阻断ASC和NLRP3之间的相互作用。DMQ治疗组可显著降低小鼠血清和腹腔液中IL-1β的分泌水平(P<0.05)并延长小鼠生存时间(P<0.05)。结论 发酵小麦胚芽提取物主要活性成分DMQ通过阻断ASC和NLRP3之间的相互作用有效抑制NLRP3炎症小体活化并缓解LPS诱导的小鼠感染性休克。

肿瘤相关成纤维细胞上调hsa-miR-18b-5p靶向FBXL3促进前列腺癌的增殖及转移

目的探讨受肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)调控的hsa-miR-18b-5p在前列腺癌(PCa)中的表达水平及作用,并研究对其在PCa发生发展过程中的分子机制。方法利用生物信息学技术分析在PCa中高表达的miRNA,构建肿瘤相关成纤维细胞并与PCa细胞系共培养,验证CAFs对PCa细胞增殖和迁移的影响及对hsa-miR-18b-5p的调控作用;RT-qPCR验证20例患者癌组织及癌旁正常组织、前列腺正常上皮增生细胞及PCa各细胞系中hsa-miR-18b-5p的表达水平;通过脂质体法将阴性对照及hsamiR-18b-5p抑制物分别转染入PCa细胞C4-2、LNCAP中,分为NC inhibitor组和hsa-miR-18b-5p inhibitor组;采用细胞集落形成、CCK-8实验、划痕愈合、Transwell、IC_(50)实验、流式细胞术分别检测C4-2、LNCAP细胞增殖、迁移、侵袭、耐药能力、凋亡和周期;建立PCa裸鼠移植瘤模型,定期测量移植瘤的质量和体积,Kaplan-Meier生存曲线分析裸鼠生存情况;利用靶基因预测分析网站(Targetscan、Mirtarbase、miRDB、miRDIP)预测has-miR-18b-5p的靶基因,并通过双荧光素酶报告基因分析验证hsa-miR-18b-5p与靶基因的靶向关系,RT-qPCR、Western blotting检测各组细胞靶基因的表达水平。结果生物信息学分析结果显示,在PCa中高表达的miRNA有17个,结合差异表达程度以及相关文献筛选出拟研究的基因:miR-148a、miR-17、miR-18b-5p、miR-770、miR-297-3p。CAFs与PCa细胞系共培养后hsa-miR-18b-5p的表达水平升高(P<0.01),且促进PCa细胞的增殖与迁移(P<0.01),敲除has-miR-18b-5p可抵消CAFs对PCa细胞增殖及迁移的影响,确定has-miR-18b-5p为研究基因。与正常前列腺上皮细胞或肿瘤旁组织相比,PCa细胞或肿瘤组织中hsa-miR-18b-5p的表达升高(P<0.05);敲除hsa-miR-18b-5p可抑制C4-2、LNCAP细胞的增殖、迁移、侵袭以及耐药(P<0.05);敲除hsa-miR-18b-5p可抑制裸鼠移植瘤质量和体积的增长,增加裸鼠的生存时间(P<0.05)。靶基因预测分析网站显示,FBXL3是hsa-miR-18b-5p的一个潜在作用靶点,双荧光素酶报告基因证实has-miR-18b-5p与FBXL3基因间存在结合位点,且敲除hsa-miR-18b-5p可增加C4-2、LNCAP细胞中FBXL3的蛋白表达(P<0.05)。结论CAFs上调前列腺癌细胞hsa-miR-18b-5p的表达水平,后者可能通过靶向调控FBXL3基因的表达促进PCa细胞的增殖和转移。

甲基巴多索龙通过抑制NLRP3炎症小体活化缓解小鼠急性肝损伤

目的探究小分子化合物甲基巴多索隆(CDDO-Me)抑制NLRP3炎症小体活化并缓解急性肝损伤的作用机制。方法体外实验:CDDO-Me预处理小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMDM)或人急性单核细胞白血病(THP-1)细胞后,利用多种NLRP3炎症小体活化剂(Nigericin、ATP、MSU、胞内LPS转染)活化NLRP3炎症小体,使用聚脱氧腺苷酸(poly A∶T)活化AIM2炎症小体,通过Western blotting和ELISA检测细胞培养上清中caspase-1和白细胞介素1β(IL-1β)的分泌水平,确定CDDO-Me对NLRP3炎症小体的抑制效果及其特异性。体内实验:将SPF级雄性C57BL/6J小鼠随机分为4组,即空白对照组(Control组)、急性肝损伤组(APAP组)、CDDO-Me低剂量治疗组(APAP+CDDO-Me20 mg/kg组)和CDDO-Me高剂量治疗组(APAP+CDDO-Me40 m/kg组),ELISA检测小鼠血清中IL-1β、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)的表达水平,HE染色观察肝组织结构变化。结果CDDO-Me可剂量依赖性的抑制多种激动剂诱导的NLRP3炎症小体活化以及胞内转染LPS诱导非经典NLRP3炎症小体的活化(P<0.05),但对NLRP3炎症小体非依赖的相关炎性因子白细胞介素6(IL-6)、TNF-α的分泌无显著影响(P>0.05)。此外,CDDO-Me对AIM2炎症小体的活化无显著影响(P>0.05)。动物实验结果表明,相较急性肝损伤组(APAP组),CDDO-Me治疗组(APAP+CDDO-Me20 mg/kg组和APAP+CDDO-Me40 mg/kg组)小鼠血清IL-1β、AST和ALT的表达水平显著降低,肝组织HE染色结果显示CDDO-Me能明显改善ALI小鼠损伤的肝组织结构,减少炎性细胞浸润,且呈剂量依赖性(P<0.05)。结论CDDO-Me能够特异性抑制NLRP3炎症小体活化并缓解APAP诱导的小鼠急性肝损伤。

LPS诱导的巨噬细胞来源外泌体促进巨噬细胞抗结核分枝杆菌自噬

目的:探讨LPS诱导的巨噬细胞来源外泌体对巨噬细胞抗结核分枝杆菌(M.tb)自噬的作用及机制研究。方法:使用THP-1细胞诱导建立H37Ra感染巨噬细胞模型,抽提并鉴定巨噬细胞外泌体;抽提LPS诱导的巨噬细胞外泌体与H37Ra感染巨噬细胞共培养,使用Dil荧光标记外泌体,荧光显微镜观察外泌体吸收情况,采用荧光定量PCR、流式细胞术、Western blotting等方法,明确外泌体对巨噬细胞抗M.tb自噬的影响。结果:成功抽提并鉴定LPS刺激的巨噬细胞外泌体,吸收普通外泌体的巨噬细胞自噬水平无明显变化,吸收LPS诱导的外泌体后的巨噬细胞其自噬水平显著提高,共培养时加入外泌体抑制剂后促进巨噬细胞自噬作用消失;H37Ra感染的巨噬细胞吸收LPS诱导的外泌体后,其自噬水平增强,显著提高对M.tb的杀伤能力及人白细胞介素12的分泌。结论:LPS诱导的巨噬细胞来源外泌体可促进巨噬细胞抗M.tb自噬。