永生化猪视网膜色素上皮细胞的建立及初步应用

【目的】建立永生化猪视网膜色素上皮细胞系,为病毒学研究提供一种新的细胞材料。【方法】合成猪腺病毒3型E1基因,将其克隆至真核表达质粒pCI-neo中,构建E1基因真核表达质粒pCI-neo-E1,进行PCR和测序鉴定。提取pCI-neo-E1质粒,转染原代猪视网膜色素上皮细胞,用新霉素G418筛选猪永生化视网膜色素上皮细胞系(RPECs)。检测RPECs的角蛋白18和19,通过细胞计数测定其生长曲线,流式细胞仪检测细胞周期,并对其进行染色体核型分析。分别将猪流行性腹泻病毒(PEDV)CV77毒株、猪圆环病毒2型(PCV2)DBN-SX07株和猪伪狂犬病毒(PRV)Bartha-K61株接种RPECs,同时将PEDV CV77毒株接种绿猴肾细胞(Vero细胞),将PCV2 DBN-SX07株接种猪肾细胞(PK15细胞),将PRV Bartha-K61株接种仓鼠肾成纤维细胞(BHK细胞),观察细胞病变效应(CPE),并采用间接免疫荧光法测定病毒的滴度。【结果】PCR和测序结果显示,真核表达质粒pCI-neo-E1构建成功。将pCI-neo-E1转染原代猪视网膜色素上皮细胞,经G418筛选得到永生化细胞株,该细胞株表达角蛋白18和19,传代50代仍保持上皮样细胞形态,增殖活性良好,细胞周期及染色体核型特征与正常的二倍体细胞一致。PEDV CV77毒株感染猪RPECs 24 h后,CPE明显,滴度为10^(5.25)TCID_(50)/mL,低于其在Vero细胞中的滴度(10^(8.125) TCID_(50)/mL)。PCV2 DBN-SX07毒株感染猪RPECs后可产生明显CPE,病毒滴度为10^(6.125)TCID_(50)/mL,略高于其在PK15细胞上的滴度(106.0 TCID_(50)/mL)。PRV Bartha-K61毒株感染猪RPECs后,CPE明显,病毒滴度为10^(8.75)TCID_(50)/mL,略低于其在BHK上的滴度(108.875 TCID_(50)/mL)。【结论】成功构建了永生化猪视网膜细胞系,可用于猪源病毒的培养,尤其是培养PCV2可产生明显CPE,易于观察,为后续开展疫苗工艺的提升提供了一种新的细胞材料。

猪源和犬源ELF4蛋白的亚细胞定位比较研究

本研究旨在对比分析猪E74样因子4(sELF4)和犬E74样因子4(cELF4)的亚细胞定位,为深入开展二者功能研究提供依据。利用PCR截短扩增sELF4和cELF4,分别克隆至真核表达载体pEGFP-C1中,构建17个sELF4重组真核表达载体和13个cELF4重组真核表达质粒,转染HeLa细胞、Hoechst33342染色,荧光倒置显微镜观察亚细胞定位,运用生物信息学软件分析其编码氨基酸序列特征。结果表明,sELF4和cELF4蛋白全长均定位在细胞核中,sELF4 196~291 aa(586~873 bp)之间有可能存在两个细胞质核定位信号肽,cELF4的核定位信号肽分布在203~291 aa(607~873 bp),cELF4 292~663 aa(874~1 992 bp)、sELF4 292~662 aa(874~1 989 bp)在细胞中发生聚集现象。cELF4与sELF4氨基酸序列在第169~303位氨基酸之间均高度保守,其他区段均存在不同程度的差异。综上,sELF4蛋白全长和cELF4蛋白全长均定位在细胞核中,截短表达的羧基端功能区有聚集现象,二者的核定位信号肽分布有一定差异。

猪胆囊收缩素与生长抑素的融合表达与鉴定

研究旨在运用原核表达系统制备重组猪胆囊收缩素与生长抑素融合蛋白(rpCCK-SS)。人工合成猪胆囊收缩素与生长抑素融合基因(pCCK-SS),分别克隆至pET28a和pCold GST载体中,转化BL21 (DE3)或Transetta (DE3),构建重组表达菌株,采用双酶切和测序鉴定;并通过进行SDS-PAGE检测和Western blot鉴定优化诱导剂浓度和诱导时间。结果显示,pCCK-pSS基因全长693 bp,共编码231 aa;BL21 (DE3)-pET28apCCK-SS表达目的蛋白分子量25 kDa,以包涵体形式存在;Transetta (DE3)-pCold-pCCK-SS表达目的蛋白分子量50 kDa,在上清与沉淀中均有表达,以沉淀中的包涵体形式为主,最优表达条件为15℃、0.25 mmol/L IPTG浓度诱导8 h。研究表明,试验成功运用两个表达载体表达了rpCCK-SS,且pCold GST的表达效果优于pET28a,为进一步开发新型促生长制剂奠定了基础。

猪圆环病毒3型Cap蛋白的原核表达与鉴定

[目的]研究旨在扩增PCV3病毒的Cap基因,体外表达PCV3 Cap蛋白。[方法]试验分别建立重组原核表达载体p ET28a-PCV3-Cap和p Cold-PCV3-Cap,转化Rosetta(DE3)表达菌株,在不同温度条件下诱导表达蛋白,采用SDS-PAGE和Western blotting进行蛋白鉴定。[结果]PCV3 Cap蛋白在p ET28a原核表达系统中无表达;Rosetta-p Cold-PCV3-Cap在诱导温度为15℃、IPTG浓度为1.0 mmo L/L、诱导4 h的条件下,能够表达分子量约为25 k Da的Cap蛋白,且为可溶性表达。[结论]试验成功制备了PCV3 Cap蛋白,为制备PCV3疫苗及其诊断方法的研究提供了基础材料。

音乐对猪的影响研究进展

猪只具有和人类非常相似的耳蜗,小型猪耳蜗的精细结构包括前庭鳞片、鼓膜鳞片、鼓膜鳞片、齿状骨、齿状骨韧带和耳蜗隔断,可以感知声音。声振动的频率以赫兹(Hz)为单位,猪只的听觉范围从42~40.5 kHz,最佳灵敏度区域从250~16 kHz。音乐能影响动物的情绪、学习和记忆能力。

水合三环己基锡4-吡啶甲酸酯配合物的合成、结构及抗癌活性

三环己基氢氧化锡与4-吡啶甲酸按物质的量比1∶1在乙醇溶剂中反应,合成了水合三环己基锡4-吡啶甲酸酯配合物。采用元素分析、红外光谱、核磁共振、差热分析和X-射线单晶衍射等对配合物进行了结构表征,并对配合物进行量子化学计算和体外抗癌活性研究。结果表明:配合物中心锡原子为五配位畸变三角双锥构型;配合物对人肝癌细胞(HUH7)、人肺腺癌细胞(A549)、人表皮癌细胞(A431)和人结肠癌细胞(HCT-116)的抑制活性高于顺铂。

KLK7小分子抑制剂对卵巢癌SKOV3细胞增殖、侵袭与转移的影响

为了探讨KLK7小分子抑制剂G284-1264对卵巢癌SKOV3细胞增殖、侵袭和转移的影响,采用MTT法检测G284-1264处理后细胞的存活率;钙黄绿素-AM/PI活细胞/死细胞双染和流式细胞术检测细胞凋亡、细胞周期分布,同时用细胞划痕实验检测G284-1264对SKOV3细胞侵袭与转移的影响。结果显示:相同时间作用下,随着G284-1264浓度增大,SKOV3细胞存活率逐渐降低,24 h、48 h和72 h的IC50分别为110.0、48.62和39.64μmol/L,相比5-FU,G284-1264对SKOV3细胞表现出更强的抗增殖能力;钙黄绿素-AM/PI对细胞进行双染后,G284-1264作用组细胞活力明显降低;流式细胞术分析发现,G284-1264作用组G1期的细胞数目增加,G2期明显降低,且凋亡率高于空白组和阳性对照组;划痕实验表明G284-1264处理细胞36 h后,细胞迁移率降低16.49%。以上结果表明KLK7小分子抑制剂G284-1264能明显抑制人卵巢癌SKOV3细胞的增殖、侵袭与转移。

犬冠状病毒S1蛋白特异性小分子抗体Fab的制备

为表达犬冠状病毒(canine coronavirus,CCV)S1蛋白,制备其特异性小分子抗体Fab,为CCV的防治提供新材料。采用PCR扩增CCV S 1基因全长及其截短片段,分别克隆到原核表达载体pET28a或pGEX4T-1中,转到BL21(DE3)或Rosetta(DE3)感受态细胞构建重组表达菌株;用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导目的蛋白表达,通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western blot鉴定分析重组蛋白;纯化蛋白分别与ISA71AVG或ISA201VG佐剂配伍乳化后制备免疫原,免疫蛋鸡,用聚乙二醇(PEG)沉淀法提取得到CCV S1蛋白的卵黄抗体,通过Western blot检测抗体滴度,用胃蛋白酶水解卵黄抗体制备小分子抗体Fab。结果显示,S1蛋白全长无表达,CCV S1-a和CCV S1-b分子量分别为79 ku和68 ku。在免疫后第35天2种佐剂组的卵黄抗体滴度可达1∶128000。制备小分子抗体Fab最佳酶切条件为卵黄抗体与胃蛋白酶混合质量比20∶1、pH值4.1、37℃酶切8 h。完整的IgY可以与CCV呈特异性反应,胃蛋白酶处理后制备的小分子抗体Fab可以有效阻断CCV的感染性。综上,本研究成功表达了CCV S1的2个截短片段蛋白,制备了卵黄抗体及其小分子抗体Fab,为进一步开展犬冠状病毒病的诊断和防治技术研究奠定了基础。

猪CD163基因的克隆及截短原核表达

(目的)研究旨在克隆猪CD163 (pCD163)基因、体外表达CD163蛋白。(方法)采用RT-PCR扩增猪CD163基因,运用生物信息学软件分析其核苷酸和编码氨基酸序列,将猪CD163的两个截短基因片段(1-1749 bp和1717-3348 bp)克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,构建重组原核表达载体,转化Transetta(DE3)菌株,IPTG诱导蛋白表达,采用SDS-PAGE和Western blot进行蛋白鉴定。(结果)结果表明,pCD163开放阅读框为3348 bp(GenBank:OM321546),编码1116 aa,蛋白分子量为120.5 kDa,该基因与已经测定的人、绿猴、牛、狼的CD163的核苷酸相似性依次为87.8%、88%、87.4%和88%,pCD163基因与抹香鲸和牛的CD163基因亲缘关系最近,与人、狼和绿猴的亲缘关系相对较近;pCD163截短片段1-1749蛋白分子量为92 kDa,截短片段1717-3348蛋白分子量为85 kDa,均以包涵体形式表达。(结论)试验成功克隆了pCD163基因,两个截短基因片段在原核细胞中均以包涵体形式表达,为后续开展该蛋白生物学功能研究提供了基础材料。

大孔树脂分离纯化紫苏叶总黄酮的工艺研究

为优化紫苏叶总黄酮的大孔树脂分离纯化工艺,以静态吸附率和解吸率为指标,比较了5种不同大孔树脂对紫苏叶总黄酮的吸附和解吸能力,筛选最优树脂,确定了最佳工艺参数。结果显示,D101型大孔树脂对紫苏叶总黄酮有较好的吸附和解吸效果,最佳条件为样品质量浓度3 mg·mL^(-1)、树脂质量3 g、pH4、50 mL 70%乙醇洗脱。此条件下,紫苏叶总黄酮的纯度为70.90%。

柞市麻羊生产性能及肉品质研究

试验旨在对特色羊品种柞市麻羊的生产性能及肉质性状进行详细的介绍。采集柞市麻羊的背最长肌和股四头肌,采用国标法测定其胴体性能、肉质性状、质构特性、肌纤维特性以及肌肉的常规营养成分。结果表明,不同月龄柞市麻羊的宰前活重介于20.00~26.50 kg、胴体重介于8.50~11.40 kg、屠宰率介于42.50%~43.01%。麻羊羊肉粗蛋白含量介于9.13%~12.25%,粗脂肪含量介于0.93%~1.08%,钙、磷含量分别介于2.24%~3.36%和0.31%~0.42%。麻羊胸部肌肉的红度(a*值)和黄度(b*值)低于腿部,亮度(L*值)则相反;麻羊胸部肌肉的系水力较腿部好,p H和熟肉率低于腿部,新鲜腿部肌肉剪切力值低于胸部,蒸煮后则相反。麻羊胸部肌肉的硬度、胶着性和咀嚼性高于腿部,黏附性、回复性、内聚性以及弹性没有较大差异。麻羊胸部的肌纤维密度、细胞直径以及细胞面积都高于腿部。综上说明,柞市麻羊羊肉是一种高蛋白、低脂肪的优质蛋白质肉食品,具有较强的市场竞争优势和广泛的养殖前景。

紫苏叶中α-淀粉酶抑制剂的提取工艺研究

本研究以紫苏叶为原料,选取料液比、提取温度、乙醇浓度和提取时间为自变量,α-AI的抑制率为因变量,采用超声辅助溶剂法提取α-AI。结果表明,在料液比为1∶20(g∶mL),提取温度为60℃,乙醇浓度为70%,提取时间为70 min的条件下,提取的α-AI抑制率平均值为59.12%。

NaCl胁迫对辣椒种子萌发及幼苗生长的影响

为探究辣椒(Capsicum annuum L.)种子和幼苗对盐胁迫的生理响应机制,本研究以3个不同基因型的辣椒品种为试验材料,研究不同浓度NaCl胁迫对辣椒种子萌发和幼苗生长的影响,并通过隶属函数值法对辣椒品种及不同处理阶段的耐盐性进行综合评价。结果显示,随着NaCl浓度的升高,3个辣椒品种的发芽率、发芽指数、发芽势和胚根长均呈现下降趋势,而胚芽长和鲜重则呈现先上升后下降的趋势。在NaCl浓度为200 mmol/L时,3个辣椒品种种子的萌发均受到显著抑制,表明萌发过程中辣椒种子仅可适应低于200 mmol/L NaCl的盐胁迫,200 mmol/L可作为辣椒种子耐盐性的筛选参考浓度。耐盐性综合评价表明,低盐条件下‘Wanyu’和‘Liu58’品种的耐盐性较好,而高浓度的盐胁迫下‘HJ10-1’则具有更好的耐盐性。辣椒幼苗体内的各项生理指标均对盐胁迫有响应,丙二醛(MDA)、脯氨酸(Pro)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)的含量或活性随NaCl浓度的升高而增大;过氧化物酶(POD)、叶绿素、根系长和根系面积的含量或长度则随NaCl浓度的升高呈现先升高后降低的趋势,叶绿素、根系长和根系面积的含量或长度在NaCl浓度为100 mmol/L时达到峰值,POD的活性则在NaCl浓度为200 mmol/L时达到峰值。本研究结果不仅有助于辣椒盐胁迫生理响应机制的解析,且为辣椒耐盐品种的选育提供了科学依据。