动物细胞永生化研究进展

细胞永生化是指通过各种手段、方式来突破原代细胞衰老的限制,延长细胞寿命,实现细胞无限复制增殖,是当前生物医学领域研究的一个热点与难点。永生化细胞株/系可用于生物制品研发、衰老机制探索以延伸生命等;然而目前永生化细胞种类不多、永生化技术相对较难,肿瘤风险以及动物福利伦理等原因,还不能满足研发需求。目的细胞永生化不仅可以永久保存动物细胞遗传资源,还对多种疾病的诊断、治疗及细胞基质疫苗的研发等提供支持。本文就动物细胞永生化的原理、永生化机制及方法的研究最新进展进行综述,为未来的生物医学研究和应用提供参考。

MDCK细胞无血清悬浮培养技术在流感疫苗研究与生产中的应用进展

流感是一种常见的呼吸道疾病,由流感病毒引起,接种疫苗是预防流感的有效手段。MDCK细胞(Madin-Darby Canine Kidney Cells)具有易于培养和高产量的特点,可以支持流感病毒的复制和增殖,被广泛用于流感疫苗的研究和生产。随着对流感病毒研究的不断深入,为了进一步拓展MDCK细胞用于流感病毒研究和工业应用的能力,研究人员开始发展MDCK细胞无血清全悬浮培养技术。通过长期的培养和优化,驯化的MDCK悬浮细胞株可以更好地适应流感病毒的生长环境,提高流感病毒的产量和感染性。总之,MDCK细胞无血清悬浮培养技术在流感病毒研究和工业应用中发挥着重要作用,为流感疫苗生产和抗流感药物研发提供更好的工具。同时也必须重视MDCK细胞的安全性,采取合适的措施来确保其应用的安全性和可靠性。

动物细胞生物反应器研究进展

细胞基质生物制品大规模生产工艺的选择首要考虑因素是该产品工艺所涉及的生物反应器系统。论文针对动物细胞培养的基本特点,就不同动物细胞生物反应器的结构和原理、优点与缺点、结构优化、传感器最新进展等进行了综述,其目的在于为生物制品研发和生产实际应用中选择更加适合培养工艺的生物反应器,提高动物细胞大规模培养生产生物制品的效率,也为促进新型生物反应器的研究与开发提供一定的参考。

人胚肺细胞系(MU-L1)生物学特性研究

目的:对新建人胚肺细胞系(MU-L1)的生物学特性进行评价,以期建立可用于疫苗生产的人二倍体细胞株.方法:使用不同培养基及血清、不同血清浓度和传代比例培养MU-L1细胞,通过细胞形态、增殖速率和生长动力学等进行比较分析,筛选出较适宜的培养条件,用适宜的培养条件连续培养细胞至生命周期结束.传代过程中检查无菌、支原体和外源病毒因子,并进行染色体核型分析.结果:在常用培养基(MEM、DMEM、M199、DME/F12和PRMI1640)、胎牛血清和新生牛血清中MU-L1细胞均良好生长;按1∶4传代比例,使用含10%新生牛血清的MEM培养基培养,可培养至67代(世代),在生命周期的不同阶段经液氮冻存,复苏活率在91.56%~98.92%,生长良好.染色体核型为正常人二倍体核型,2n=46,无菌、支原体和外源病毒因子检查均为阴性.结论:MU-L1为正常人二倍体细胞系,具备作为病毒性疫苗基质进一步研究和生产应用的价值.

动物细胞低氧培养相关调控因子研究进展

近年来低氧细胞培养逐渐成为研究热点,低氧条件下可提高细胞体外扩增的生长动力学、细胞的增殖率及干细胞分化等功能。缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)是应答低氧应激的关键因子,也是介导低氧信号的转导中枢,与其相关的血管内皮生长因(vascular endothelia growthfactor,VEGF)、低氧促有丝分裂因子(hypoxia-induced mitogenic factor,HIMF)及促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)等是其重要的靶基因,它们之间的相互作用对低氧条件下细胞的发生、发展有重要作用。笔者对低氧培养细胞的研究现状及低氧相关细胞因子的调控机制及作用进行概述,以期为探索细胞低氧机理提供理论依据,为低氧适应性及高原疾病治疗提供更多的研究思路。

稳定过表达犬EGFR蛋白的MDCK细胞的建立及其对凋亡和细胞周期的影响

表皮生长因子受体(EGFR)在许多实体肿瘤中过度表达,建立稳定过表达犬EGFR蛋白的MDCK细胞株,有利于为研究犬或人类肿瘤疾病提供良好的细胞模型和研究基础。首先制备目的片段以构建EGFR基因过表达载体,与慢病毒包装载体共同转染至293T细胞中,48 h后提取上清液经纯化获得EGFR基因过表达慢病毒液。将其转染至MDCK细胞中,经嘌呤霉素筛选和单细胞克隆后观察感染效率,RT-qPCR和Western Blot、间接免疫荧光分别检测基因及蛋白的表达,建立EGFR蛋白过表达MDCK细胞株。使用流式细胞仪分别检测过表达及对照细胞株的细胞凋亡和细胞周期。犬EGFR基因位于18号染色体,由编码跨膜糖蛋白的30个外显子组成。经反应体系,PCR产物交换入线性化表达载体,获得了阳性转化子8个,大小为738 bp。所获EGFR基因过表达慢病毒滴度为3.5×10^(8 )TU/mL。转染MDCK细胞后在荧光显微镜下观察荧光效果显著,经检测EGFR基因及其蛋白在细胞中的表达量显著升高。间接免疫荧光试验显示,EGFR在细胞中表达明显增强。过表达细胞的早期凋亡率和晚期凋亡率显著上升,且在G2/M期发生阻滞。成功建立一株稳定的犬EGFR过表达MDCK细胞株,犬EGFR的过表达催化了细胞分裂,使DNA复制加快,同时刺激了细胞凋亡。

低氧下牦牛、黑白花牛肾间质成纤维细胞PDK1、Smad2、Caspase3等因子表达差异研究

为了比较低氧条件下不同海拔牛种肾间质成纤维细胞(RIFs)内PDK1、Smad2、Caspase3等因子的表达差异及细胞增殖差异,并进一步探究牦牛肾脏的高原低氧适应性特点,本研究采用牦牛和黑白花牛RIFs作为研究对象,低氧(1%O2)处理后,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白免疫印迹(WB)法检测细胞内PDK1等因子表达差异。波形蛋白(Vimentin)免疫组化染色鉴定结果显示,两种牛的原代RIFs纯度较高,可用于后续试验。低氧处理后,两种牛的RIFs内PDK1、Smad2及Caspase3的mRNA和蛋白表达均存在不同程度上调,且种属间存在显著差异(P<0.05),牦牛HIF-1α、PDK1、Smad2及Caspase3等基因表达量于24 h达到峰值,之后下调,而黑白花牛基因则随时间呈递增趋势,且牦牛RIFs低氧下增殖能力低于黑白花牛。综上所述,低氧诱导的相关转录因子表达存在差异,两种牛RIFs的增殖能力存在差异,这可能是导致低氧下黑白花牛肾纤维化程度的加深,从而产生肾源性高原疾病的原因之一。本研究为比较不同海拔牛种肾脏的低氧适应性研究提供了基础数据,为探索牦牛肾脏高原低氧适应机制提供了一定的理论依据。

不同批次新生牛血清对MDCK细胞培养效果的研究

为筛选适宜MDCK细胞生长的最佳血清,分析6个批次新生牛血清在两种培养方式即贴壁静置培养条件下MDCK细胞的生长状态、平均集落形成率及微载体悬浮培养条件下MDCK细胞的生长状态、生长速率、生长动力学情况。结果表明6组新生牛血清贴壁静置培养的MDCK细胞,平均集落形成率最大的为第Ⅴ组,最小的为第Ⅰ组,由大到小依次为第Ⅴ、Ⅵ、Ⅲ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅰ组;微载体悬浮培养条件下的MDCK细胞,最大增殖密度从大到小依次为第Ⅳ、Ⅲ、Ⅵ、Ⅴ、Ⅱ、Ⅰ组,平均倍增时间由大到小依次为第Ⅵ、Ⅴ、Ⅲ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅰ组。因此,通过对不同批次血清贴壁静置培养的MDCK细胞生长状态、平均集落形成率及微载体悬浮培养的MDCK细胞生长状态、生长动力学评价,筛选出适宜细胞生长的新生牛血清批次为第Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ组,而第Ⅰ组新生牛血清对细胞生长的促进效果不明显,细胞生长状态不佳。

西北部分地区密点麻蜥线粒体基因系统进化分析

研究旨在探讨西北地区密点麻蜥的系统进化关系,对密点麻蜥的线粒体ND2与ND4基因进行扩增并测序,基于ND2与ND4基因与国内其他麻蜥品种构建系统进化树,分析系统进化关系。结果显示,甘肃盐池湾与内蒙古鄂前旗的密点麻蜥存在基因流。基于ND2基因建立的系统进化树显示,宁夏沙坡头的密点麻蜥M88与内蒙古乌审旗的M102也存在基因流。研究表明,为保护密点麻蜥的种质资源和维护物种多样性,在制定保护措施时应避免过度的基因交流,并适当控制与近缘物种的渗透杂交。

病毒类基因工程疫苗研究进展

疫苗接种被认为是控制病原体和预防人类以及动物疾病最有效的方法之一.近年来由于病毒性疾病来势汹汹,传统疫苗如灭活或减毒活疫苗的局限性及潜在问题日益突显,而基因工程技术的进步使得疫苗设计和研发得以改进,由此衍生的病毒类基因工程疫苗作为下一代疫苗越来越受到研究者的高度关注.通过病毒类基因工程疫苗的类型,重点介绍不同疫苗的开发原理、特点及用途,探讨其应用前景和发展趋势,旨在为新发病毒类疾病疫苗的研发提供参考.

原代藏獒细胞培养与生物学特性研究

为研究藏獒体细胞的生物学特性,保存藏獒遗传资源,以实验室前期自主分离的藏獒肾脏细胞为材料,探讨了其体外培养的形态特征、传代次数、冻存复苏、生长特性、细胞核型以及G418最低致死浓度。结果表明:藏獒肾脏细胞体外培养时形态均为成纤维细胞,形状梭形,呈放射状与旋涡状样式生长;细胞冻存后复苏活率为91%,且复苏后形态与长势均呈现良好状态;F_(1)代至F_(5)代,细胞增殖较快,F_(5)代至F_(8)代,细胞增殖减弱甚至停滞,细胞呈多边形状态,出现细胞脱落现象,最终于F_(8)代无法继续生长;生长曲定结果显示,24孔板内细胞数目最高值达到4.06×10^(5)个/mL,最短倍增时间为27 h;藏獒核型2n=78;藏獒肾脏细胞的G418筛选最低致死浓度为500μg/mL。

生物反应器培养BHK-21悬浮细胞增殖伪狂犬病病毒工艺优化

旨在筛选伪狂犬病病毒(PRV)敏感的BHK-21细胞并分析其生长和病毒增殖特性,优化反应器中BHK-21悬浮细胞的培养和病毒增殖条件,建立生物反应器培养BHK-21悬浮细胞增殖PRV工艺。本研究利用响应面和单因素优化法,以细胞生长动力学特性、TCID_(50)病毒滴度等参数为指标,优化1.2 L生物反应器中BHK-21悬浮细胞的最佳培养和增殖病毒条件,在5 L生物反应器中进一步批培养验证。结果显示,筛选获得PRV高敏感的BHK-21-02贴壁细胞和BHK-21-XF02悬浮细胞各1株,BHK-21-XF02悬浮细胞在含3%血清的SLM-BHK低血清培养基和SFM-BHK无血清培养基中均能实现良好的生长和病毒增殖。利用响应面法优化得到1.2 L反应器最佳培养条件为接种密度1.20×10~6cells·mL^(-1)、搅拌转速120 r·min^(-1)、DO值40%,5 L反应器批培养72 h细胞密度可达(7.61±0.18)×10~6 cells·mL^(-1)、细胞活率为(96.93±1.18)%。利用单因素法优化得到1.2 L反应器最佳病毒增殖条件为MOI 0.001、培养温度37℃、细胞密度2.0×10~6cells·mL^(-1)、搅拌转速80 r·min^(-1),5 L反应器批培养接毒后48 h病毒滴度达到最大值(7.13±0.11)lgTCID_(50)·mL^(-1)。本研究可为PRV疫苗相关研究和规模化生产提供参考。

流式细胞术优化MDCK细胞基因转染效率的研究

为探究脂质体介导的MDCK细胞基因转染效率,并获得最佳的优化方案,本研究选取不同配比的质粒和脂质体浓度,将p-EGFP-C1质粒转入MDCK细胞.转染后36 h,利用台盼蓝染色法检测细胞活率,流式细胞术检测细胞中增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的表达情况和转染效率,获得优化的转染条件.结果发现,转染后MDCK细胞,实验组细胞活力与阴性对照组差异不显著(P>0.05).当质粒(μg)∶脂质体(μL)浓度配比为0.5∶1.0、0.5∶1.25、0.5∶1.5时,转染率达到了较高水平,分别为(23.4±3.4)%、(24.5±4.5)%、(25.2±3.7)%,从经济因素考虑,脂质体介导的MDCK细胞基因转染质粒(μg)与脂质体(μL)的最佳配比浓度为0.5∶1.0.这为MDCK细胞用于基因转染提供了一定的理论基础.

不同类型牛血清对MDCK细胞培养效果研究

为建立贴壁培养型细胞最适血清的快速筛选方法,在含10%不同类型牛血清的DMEM培养液中连续传代培养MDCK细胞,分别用传代稳定性观察、绘制生长曲线、分析生长动力学与贴壁率的方法评价不同类型牛血清对MDCK贴壁细胞促生长效果的影响,并进一步在细胞工厂中扩大培养验证。结果显示,3种类型血清均能较好促进细胞的生长增殖且细胞生长曲线均呈"S"型;MDCK细胞生长动力学分析发现3种类型血清平均比生长速率差异不显著(P>0.05);最大增殖密度和倍增时间胎牛血清均优于新生牛血清;平均集落形成率分析发现,进口胎牛血清略高于国产胎牛血清(P=0.02)、国产新生牛血清低于国产和进口胎牛血清差异极显著(P<0.0001)。国产新生牛血清在1层和10层细胞工厂中连续传代培养MDCK细胞,细胞生长良好,传代过程中细胞生长稳定。通过研究不同类型的牛血清对MDCK细胞培养效果的影响,为疫苗生产中MDCK细胞扩大培养和短时间内成功筛选出培养MDCK细胞的最佳血清提供一定的科学依据。

昆虫细胞无血清培养基的研究

为开发昆虫细胞无血清悬浮培养基,以基础培养基Grace’s Insect medium为基础,添加葡萄糖、水解乳蛋白、酵母粉和PF-68等组份后,分别接种Sf-21、Hi-five两种昆虫细胞进行无血清悬浮培养。结果显示:两株昆虫细胞生长均较好,均能够很好的全悬浮生长,Sf-21细胞最高密度可达(39.8±2.6)×105/ml,Hifive细胞最高密度可达(44.4±1.0)×105/ml。本研究为昆虫细胞培养提供一种无血清悬浮培养基配方,为我国利用昆虫细胞杆状病毒表达系统生产生物制品提供基础保障。

动物细胞培养用片状载体特性分析

目的探讨不同片状载体的表面特性及对不同细胞的培养效果。方法选择3种片状载体(A、B、C),对其材料进行化学元素组成分析,对经0.1 mol/L NaOH溶液预处理前后的载体进行接触角检测。通过测定Vero、MDCK和MRC-5细胞在3种载体上的贴附效果和葡萄糖消耗量,并利用荧光染色法观察细胞生长状态,比较3种载体的细胞贴附率和培养效果。结果3种载体均主要由C、H、O 3种元素组成,且含有少量的N和S元素。预处理前,载体B的接触角为0°,显著低于载体A[(109±3.13)°]和C[(121±6.82)°](F均为709.1,P均<0.0001),亲水性较强,载体A和C亲水性较差;预处理后,3种载体表面的接触角均为0°,差异无统计学意义(F=0.0694,P>0.05),均亲水。培养3 h内,3种载体的细胞贴附率均在80%以上,细胞在载体纤维上均致密,长势均匀,葡萄糖消耗量曲线均趋于“S”型,细胞连续培养效果良好。葡萄糖消耗总量载体A与C基本一致,载体B低于A和C。结论对3种片状载体的化学元素组成和亲疏水特性关系进行了分析,并对Vero、MDCK和MRC-53种细胞的贴附率及培养效果进行了评价,为片状载体的后续研究及生产应用提供了参考。

MDCK悬浮细胞制备及流感病毒敏感性研究

目的建立无血清悬浮培养MDCK细胞的方法,分析其传代、线性放大过程中的稳定性及增殖流感病毒的敏感性。方法运用逐步降血清悬浮驯化法将贴壁培养型MDCK细胞驯化为无血清全悬浮培养型MDCK细胞;进一步分析其生长动力学特性、连续传代稳定性,在5L生物反应器中扩大培养;接种流感和禽流感病毒,测定不同时间HA效价、CCID50滴度,分析其病毒敏感性。结果成功将ATCC引进的贴壁培养型MDCK细胞驯化为无血清全悬浮培养型MDCK细胞(命名为MDCK-XF02细胞)并冻存;不同接种密度培养MDCK-XF02细胞最大增殖密度均达13.0×10^6 cells/mL以上,且差异无统计学意义(P>0.05);连续传代培养过程中细胞形态和生长状况稳定,比生长速率差异无统计学意义(P>0.05);三个代次的MDCK-XF02细胞以2.0×10^6 cells/mL接种于5 L生物反应器,细胞生长状态良好,倍增时间小于21 h,在批培养中细胞浓度高达(14.57±0.47)×10^6 cells/mL,比生长速率分别为(0.027±0.012)h^-1、(0.028±0.013)h^-1、(0.027±0.013)h^-1(P>0.05);接种甲型流感病毒H1N1和H3N2,HA效价达到(6~7)log2HA/25μL、CCID50为(4.35~4.68)lgCCID50/mL;接种乙型流感病毒B/P和BX-35增殖效果更好,HA效价达到(9~10)log2HA/25μL,CCID50为(6.38~7.31)lgCCID50/mL。接种重组禽流感病毒H5亚型Re-5、Re-6、Re-10均能很好的增殖,HA效价达到(7~9)log2HA/25μL、CCID50为(6.21~6.96)lgCCID50/mL。结论本研究获得一株具有自主知识产权的流感/禽流感病毒敏感的无血清悬浮培养型MDCK-XF02细胞株,实现了生物反应器高密度放大培养,为我国开展流感疫苗研究和生产提供细胞基质,也为其他动物细胞悬浮驯化提供参考。

Vero细胞基质流感疫苗研究进展

流感防控是人类至今面临的严峻挑战之一,流感疫苗接种是预防流感的关键。由于传统的流感疫苗生产工艺依赖鸡胚生产而存在局限性,规模化流感疫苗生产基质逐渐从鸡胚转为哺乳动物细胞,目前用于流感疫苗研发的常见细胞系有MDCK、Vero和PER.C6。其中Vero细胞低代次无成瘤性且已用于多种人用病毒性疫苗生产,是WHO推荐的广泛用于人和动物病毒性疫苗生产的首选细胞系,但Vero细胞基质流感疫苗在生产中仍面临挑战。现就流感疫苗研究、细胞基质流感疫苗的综合比较及Vero细胞在流感疫苗生产中所面临的困难予以综述,旨在为细胞基质流感疫苗研发提供参考。

前体脂肪细胞诱导及分化机制的研究进展

前体脂肪细胞分化过程即脂肪生成过程,在此过程中大量转录因子、非编码RNA及信号通路都发挥着重要的作用。文章综述了前体脂肪细胞分化过程中,成脂基因如C/EBPα和PPARγ等对前体脂肪细胞分化的调控;非编码RNA如长链非编码RNA(lncRNA)、小RNA(microRNA)、环状RNA(circRNA)对脂肪沉积、组织发育以及能量代谢等的调控过程;信号通路如Wnt/β-catenin信号通路、促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路、Hedgehog信号通路对脂肪细胞分化的抑制作用;还有一些酶、抑制剂等对前体脂肪细胞诱导分化的调节作用,以期为厘清前体脂肪细胞诱导及分化机制提供参考。

Marc-145细胞低血清适应培养传代稳定性和无血清驯化研究

通过驯化建立无血清悬浮培养型Marc-145细胞系,分析驯化传代对细胞特性的影响,为大规模生产疫苗用的宿主细胞提供基础。采用缓降培养液中血清浓度的方法,连续传代培养50代,并用无血清培养基进行悬浮培养驯化,对传代和驯化过程中的P10、P20、P30、P40和P50代细胞的形态、倍增时间、生长曲线、染色体和对蓝耳病病毒敏感性等特性进行对比分析。研究发现,传代过程中Marc-145细胞均呈扁平多边形上皮样生长,P10代细胞倍增时间为34.15 h,P50代细胞倍增时间为36.16 h,P50代细胞倍增时间稍有延长但差异不显著。P10、P20、P30、P40和P50代的Marc-145细胞生长曲线均呈“S”形;P10代和P50代细胞染色体众数都集中在88~90条。接种病毒后,P10、P20、P30、P40和P50细胞TCID 50间无显著差异,表明细胞传50代后,细胞特性没有发生明显变化。P50细胞进行无血清悬浮培养48 h后,细胞密度可达到4.14×106 mL-1。