国外甘蔗育种生物技术研究进展

以细胞工程、基因转移、遗传工程为特征的生物技术作为生物学研究中的一种必备手段已经得到广泛运用。近年来，澳大利亚和美国等甘蔗种植大国已在基因文库构建，分子标记或基因定位，甘蔗病害分子诊断及转基因甘蔗方面取得了很大的进展。本文就四个方面加以简要介绍，以促进我国甘蔗抗病育种和病害诊断水平的提高。

川麦冬蛴螬优势种生物学特性及危害规律研究

目的：为川麦冬蛴螬的防治提供依据。方法：实验观察与田间调查相结合。结果：危害川麦冬的蛴螬主要是灰胸突鳃金龟Ｈｏｐｌｏｓｔｅｒｎｕｓｉｎｃａｎｕｓ、暗黑鳃金龟Ｈｏｌｏｔｒｉｃｈｉａｐａｒａｕｌｅｌａ和铜绿丽金龟Ａｎｏｍａｌａｃｏｒｐｕｌｅｎｔａ。前者两年发生一代，世代重叠，以二、三龄幼虫越冬；后二者每年发生一代，均以三龄幼虫越冬。麦冬受蛴螬的危害程度与麦冬连作年限、间套作模式和土壤类型等因素有关。

球孢白僵菌的生物学特性及对小麦蚜虫的毒力

:3株球孢白僵菌 (Beauveriabassiana)Bb 0 2 ,Bb 0 3和Bb 0 7在不同温度 ,pH值和培养基上培养 ,结果表明 ,三者的最适生长温度在 2 5℃～ 30℃间 ;Bb 0 2和Bb 0 7在pH4.0～ 6 .0生长良好 ;适量的蛋白胨或酵母浸膏可促进菌株的生长 ,但对葡萄糖和麦芽糖的利用能力没有明显差异 ,三者在PPDA ,SDAY和SMAY上生长良好。生物测定表明 ,3菌株对小麦蚜虫均具有较强的毒力 ,但各菌株的最适剂量略有差异 ,其中Bb 0 2以 10 6mL-1较佳 ,Bb 0 3以 10 7mL-1最好 ,Bb0 7则介于 10 7mL-1～ 10

内毒素肝损伤过程中枯否细胞NF-κB和AP-1活性变化及其生物学意义

为探讨内毒素肝损伤过程中 ,枯否细胞 (Kupffercells,KCs)内主要转录因子Nuclearfactor kappaB(NF κB)、Activatorprotein 1 (AP 1 )活性的动态变化规律 ,采用健康昆明种小鼠 ,随机分组如下 :Lipopolysaccharide(LPS)尾静脉注射 3h的量效关系 :正常对照组和低 ( 1mg kg)、中 ( 5mg kg)、高 ( 1 0mg kg) 3个内毒素剂量组 ;注射 5mg kgLPS的时效关系 :正常对照、0 .5、1、3、5、8h组 .Electrophoreticmobilityshiftassay(EMSA)法检测KCs中NF κB、AP 1活性 .结果发现 ,内毒素肝损伤过程中 ,KCs中NF κB、AP 1在不同时效和量效均不同程度活化 .提示 ,二者的活化与炎症反应的调控机制紧密相关 。

杭州虻纤溶酶的纯化及其生物活性分析

经过 75 %硫酸铵沉淀、SephadexG 75凝胶过滤层析、DEAESephadexA 2 5离子交换层析、Benzamide Sepharose 4B亲和层析 ,从杭州虻 (Tabanushongchowensis )腹部匀浆液中分离纯化出分子量约为 36 5kD的纤溶酶THFE。经纤维蛋白平板测定表明 ,THFE既具有纤溶酶作用 ,又具有激活纤溶酶原的作用。THFE能分解纤溶酶原激活剂的生色底物———ChromozymUK及S 2 2 88,对纤溶酶的生色底物ChromozymP的活性较高 ,合成生色底物测定结果与纤维蛋白平板测定结果一致。THFE具有类胰蛋白酶活性 ,专一水解精氨酸形成的酰胺键 (或肽键 ) ,几乎不具有胰凝乳蛋白酶活性。

利用交错延伸剪接PCR技术扩增油菜花粉育性基因MS2 Bnap全长cDNA序列

交错延伸剪接PCR是一种用于分子进化研究的DNA改组技术。本实验利用其原理 ,将已获得的油菜花粉育性基因MS2Bnap有部分序列重叠的三段PCR产物作为模板进行扩增 ,获得了花粉育性基因MS2Bnap的全长cD NA序列。

华广虻(Tabanusamaenus Walker)溶纤活性蛋白的纯化及生物活性分析

经过 ７５％ 饱和度硫酸铵沉淀、 Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ７５ 凝胶过滤层析、 Ｌｙｓ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｂ 亲和层析和电泳制备洗脱，从华广虻（ Ｔａｂａｎｕｓ ａｍ ａｅｎｕｓ Ｗ ａｌｋｅｒ）腹部组织匀浆液中分离纯化出分子量约为 ６７ｋ Ｄ 的溶纤活性蛋白 Ｔ Ａ Ｆ Ｐ经纤维蛋白平板测定表明， Ｔ Ａ Ｆ Ｐ 只具有纤溶酶作用，不具有激活纤溶酶原的作用；但 Ｔ Ａ Ｆ Ｐ 能分解纤溶酶原激活剂的生色底物—— Ｃｈｒｏｍ ｏｚｙｍ Ｕ Ｋ 及 Ｓ２２８８还能水解胰蛋白酶专一底物 Ｂｚ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｎ Ａ 及 Ｃ Ｂ Ｚ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｎ Ａ，表明 Ｔ Ａ Ｆ Ｐ具有类胰蛋白酶活性，专一水解精氨酸形成的酰胺键（或肽键） Ｔ Ａ Ｆ Ｐ无胰凝乳蛋白酶活性

大麦DNA单限制性酶切选择性扩增多态性技术及其优化

建立和优化了大麦DNA单限制性酶切选择性扩增多态性技术体系 (SADF)。分别用限制酶PstI、EcoRI和MseI酶切大麦基因组DNA ,再与各自相应的人工接头连接 ,使用带三个选择碱基的引物进行选择性扩增。结果表明 :采用分别优化建立的标准PCR扩增检测体系 ,六个识别碱基的PstI和EcoRI的SADF均能得到丰富稳定的带形 ,四个识别碱基的MseI不能得到明显谱带。SADF扩增产物片段大小范围为 :PstI一般在 2 0 0～ 2 0 0 0bp ,而EcoRI在 2 0 0～ 10 0 0bp ;两者在不同大麦品种中均能检测到多态性 ,可用于不同大麦品种的检测 ,但PstI得到的带型明显优于EcoRI,在大麦中得到的片段具有范围宽、分布均匀、易于观察、多态性高等特点。

甘蔗白条病(Xanthomonas albilineans)PCR检验技术研究

应用聚合酶链式反应（ＰＣＲ）技术检测甘蔗茎白条病无症样品和细菌纯培养及ＤＮＡ，并以改良半选择培养基（ｍＸＡＭ）加以验证。结果表明，ＰＣＲ能特异性地检出白条黄单胞包括标准菌株３３９１５ＡＴＣＣ和血清型Ⅰ，Ⅱ等１９个菌株。但不能扩增其它５个分离自蔗茎的腐生黄单胞和１３个其它属种的植物细菌。能够检出少至１０ｐｇ靶细菌的总ＤＮＡ或２０个活细菌。ＰＣＲ检测灵敏度较ＥＬＩＳＡ和ＤＩＡ高１００～１０００倍。田间样品检测结果与实际发病符合度为９３．４６％。该项技术适用于国内外甘蔗种质资源交换和口岸检疫以及病害流行学研究。

用非载体转移技术选育水稻新种质研究

采用花粉管通道法，将高粱DNA导入杂交水稻亲本明恢63，当代结实率为40．21％，转化率为3.2％，其后代产生了广泛变异。通过4代选择，获得了20个变异材料。文章对其农艺性状进行了分析。

芽孢杆菌纤溶酶的纯化及其生物活性研究

芽孢杆菌 2 # (Bs- 2 )的发酵液经过硫酸铵分级沉淀、SephadexG - 75凝胶过滤层析、Q -Sepharose阴离子交换层析、电泳制备和电洗脱 ,获得一种具有纤溶活性的蛋白酶 ;该蛋白酶由 3个亚基组成 ,分子量分别约为 2 3KD ,2 2KD ,19KD ,全酶分子量约为 6 4KD ;经纤维蛋白平板测定表明 ,该酶既具有纤溶酶作用 。

利用分子标记预测杂交水稻产量及其构成因素

利用AFLP、RAPD、SSR技术分析了 10个恢复系和 5个不育系的 931个基因座 ,利用 15个亲本配制了 5 0个杂交组合 ,在泸州和重庆 2个环境下同时种植 ,考察了产量及其构成因素 ,从 931个基因座中筛选出了与之相关的阳性座位、增效座位、减效座位、非环境型座位 ,并分析了它们与杂种产量及其构成因素间的关系。结果表明 ,利用所有座位计算的遗传差异与产量及其构成因素的相关性 ,绝大多数性状未达显著水平 ,不能直接用来预测产量及其构成因素。阳性座位在一定程度上可以提高相关系数 ,因性状不同而存在差异 ,在多数性状上预测产量及其构成因素还有一定难度 ;增效座位和减效座位可以大幅度提高相关系数 ,在不同的环境下也表现一致 ,可以用来预测产量及其构成因素 ;非环境型座位计算的相关系数也较高 ,但低于增效座位和减效座位 。

棉花洞A雄性不育系花药发育的mRNA差别显示

应用cDNA AFLP(Amplifiedfragmentlengthpolymorphism)技术 ,分析了棉花洞A雄性不育和可育材料在花药发育过程中花粉发育相关基因表达的差异。结果表明 :在花药发育的相同时期 ,不育和可育花粉cDNA AFLP的谱带在单核期的差异大于减数分裂期。在花粉发育过程中 ,花粉发育相关基因的表达具有时空特异性。共回收了 6 4条差异cDNA片段 ,随机选择 3个片段标记为探针 ,RNA斑点杂交分析表明 ,GHA2 7具有花器官组织特异性 ,仅在花器官中表达 ;GHA2 8、GHA4 7则具有花药组织特异性且仅在可育花药中表达。序列相似性比较表明 :GHA2 7与植物ADP ribosylationfactor (ARF)基因有较高的相似性 ,而GHA2 8、GHA4

棉花LIM结构域基因(GhLIM1)的克隆和表达分析

LIM结构域蛋白是一个重要的发育调控因子 ,参与基因转录、细胞骨架建成和信号传导等许多发育调控过程。胞质骨架是形成和稳定细胞形态以及传递物质、能量和信息的重要成分。为研究棉花纤维细胞发育过程中胞质骨架的形成和作用机理 ,通过棉花纤维EST序列整合 ,从陆地棉徐州 14 2胚珠 (含纤维 )中扩增并克隆出棉花LIM结构域基因的编码区段。该棉花LIM结构域基因 (GhLIM1)长 84 8bp ,包含一个 5 70bp的开放阅读框 ,推导的氨基酸序列 (189个氨基酸 )与拟南芥、烟草和向日葵的LIM结构域蛋白有极高的同源性 ,而且两个LIM结构域完整。每个LIM结构域具有植物LIM结构域共有的双锌指结构C X2 C X17～ 19 H X2 C X2 C X2 C X16～ 2 4 C X2 H。RT PCR和Northern杂交分析表明 ,该基因 (GhLIM1)在陆地棉的根、茎尖、下胚轴、叶片、花蕾、花药、胚珠和不同发育时期的陆地棉纤维 (4DPA、12DPA、18DPA)以及海岛棉纤维 (18DPA)和中棉纤维 (12DPA)中均有表达 ,但GhLIM1基因在茎尖、纤维和有纤维的胚珠中表达量更高 ,因此GhLIM1基因应与棉花纤维发育有密切关系。

利用YADE法进行棉花基因组PCR步行

设计了一种依靠“Y”形接头延伸未知序列的方法 (YADE ,Y shapedAdaptorDependantExtension) ,成功地抑制了在未知序列扩增中的单引物扩增。用这种方法从棉花基因组中扩增了一个棉花胚珠cDNA片段F0 2 7的相邻序列———F0 2 7S和F0 2 7A。重叠分析表明 ,F0 2 7S与F0 2 7有 10 4bp的重叠 ,F0 2 7A与F0 2 7有 175bp的重叠。两个延伸片段分别含有 1和 3个可能的内含子 ,内含子均具有保守的边界序列GT -AG和与哺乳动物类似的分枝点序列。还对YADE法扩增未知序列的优缺点和可能的改进作了进一步讨论。

球孢白僵菌降解昆虫体壁蛋白酶基因CDEP-1的克隆与序列分析

构建了球孢白僵菌不同诱导时间的混合cDNA文库。根据丝氨酸类蛋白酶的保守区域设计引物 ,以构建cDNA文库同样的mRNA为模板 ,采用RT PCR法得到长度为 5 94bp的片段BbP。序列测定表明BbP是球孢白僵菌类枯草杆菌蛋白酶Pr1的一部分。以BbP为探针 ,从上述cDNA文库筛选得到长度为 15 5 7bp的克隆CDEP 1。CDEP 1含有一个 1134bp的开放阅读框 (ORF) ,编码 377个氨基酸、分子量为 386 16、PI=8.30 2的蛋白酶前体。CEDP 1的核苷酸序列与蛋白酶K、金龟子绿僵菌Pr1、球孢白僵菌Pr1的同源性分别为 :5 7.9%、5 4 .7%、83.3%。根据cDNA序列扩增到CDEP 1的基因组序列 ,分析表明其中含有 3个内含子。Southern杂交表明CDEP 1在球孢白僵菌是单拷贝。

野败型杂交水稻恢复基因的AFLP标记研究

选择汕优６３ Ｆ_２的高可育株和高不育株分别建立 ２个基因池，利用 ＡＦＬＰ标记技术对 ２ 池间的多态性进行了研究。分析表明，６４组引物在两池间全部扩增出了稳定、清晰的带纹，共 计３ ４７７条带。多数引物在基因池间未呈现多态性，只有引物组合Ｅ－ＡＧＣ／Ｍ－ＣＡＡ在基因池 间表现多态性，用双亲、Ｆ_１、Ｆ_２单株以及生产和育种上的骨干不育系与恢复系验证均表明这组 引物所揭示的多态性片段与恢复基因有关（命名为ＡＰ_１）。ＡＰ_１为单拷贝，与恢复基因间的距离 为 ４．７６ｃＭ。

昆虫抗菌肽及其研究进展

昆虫是世界上最大的生物种群，据估计其种类多于１０６，个体数量超过１０１８，占整个动物数量的９０％。除海洋外，其余所有的生态环境都有昆虫的分布［１］，这表明昆虫有极强的适应能力和防御能力。但研究发现，昆虫并不具有高等动物那样高度专一的免疫体系，即昆虫缺...

抗菌肽和几丁质酶基因提高烟草对黑胫病菌和赤星病菌的抗性研究

通过农杆菌介导法将加信号肽修饰的人工合成杂合抗菌肽CEMA基因(SPCEMA),苜蓿防御素基因(AFP),苦瓜几丁质酶基因(CHI)以及SPCEMA-CHI、AFP-CHI、AFP-SPCEMA双价基因导入本明烟(Nicotianabenthamiana),并对转基因烟草T0和T1代进行了抗病性检测,比较了不同转基因植株的抗病效果。研究结果表明,转基因烟草对黑胫病菌(Phytoph-thoraparasiticavar.nicotianae)、赤星病菌(Alternariaalternata)的抗性均强于非转基因烟草,病情指数差异达极显著水平,其中转AFP-CHI双价基因烟草具有较强的抗性,与单价转基因烟草的抗性差异达显著水平。但各单价转基因以及双价转基因烟草之间对上述病菌并未表现出显著的抗病性差异。结果表明植物源的抗菌肽基因与几丁质酶基因在抗植物真菌病害中具有协同增效作用。

棉花类LRR抗病蛋白(GhLRR-RL)基因的克隆及表达分析

从棉花胚珠的cDNA AFLP片段中 ,选取一个与拟南芥类LRR抗病蛋白 (LRR RL)序列相似的片段 ,用RACE方法延伸其 3′和 5′未知序列 ,得到一个棉花类LRR抗病蛋白的全长cDNA序列 (GenBank登录号 :AY0 4 0 5 32 )。该cDNA长 12 5 9bp ,包含一个 987bp的开放阅读框 ,具有Poly(A)加尾信号。推测的蛋白质包含 32 8个氨基酸 ,其中大部分是LRR区 ,其序列符合膜外LRR的共有序列LXXLXXLXXLXLXXNXGXIPXX。序列和结构比较分析表明 :该棉花LRR RL蛋白与拟南芥的两个类LRR抗病蛋白高度同源 ,而与植物的其他LRR蛋白结构不同 ,推测LRR RL蛋白属于一类新的LRR蛋白。斑点杂交和 3′RACE扩增表明 ,棉花LRR RL基因具有组成性表达的特点。