骨髓源性间充质干细胞通过抑制EMT改善TGF-β1诱导的大鼠肾小管上皮细胞纤维化

目的:探索骨髓源性间充质干细胞(MSCs)条件培养基是否通过调控galectin-3/Akt/GSK3β1/Snail信号通路抑制上皮细胞-间充质细胞转换(EMT)改善抗转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E)纤维化.方法:①无菌条件下取年轻SD大鼠股骨和胫骨骨髓贴壁培养,常规体外传代培养至P3代后,更换无血清的低糖DMEM培养基培养48h,收集细胞上清制备MSCs条件培养上清(SF-MSCs-CM).②按照正常大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E)的干预方式将其分5组,正常组(不干预)、TGF-β1干预组、TGF-β1+SF-MSCs-CM干预组、TGF-β1+SF-DMEM(无血清低糖DMEM)干预组以及SF-MSCs-CM组.人重组TGF-β1(15ng/mL)处理NRK-52E细胞72h建立大鼠肾间质纤维化模型.建模成功后的干预组再分别用SF-MSCs-CM和SF-DMEM处理24h,SF-MSCs-CM组仅加SF-MSCs-CM处理24h.③利用慢病毒载体转染NRK-52E细胞,建立galectin-3敲低(Gal-3 KD)和galectin-3过表达(Gal-3 OE)工具细胞,分组及处理同前述.采用免疫印迹法检测纤维化相关指标.结果:TGF-β1明显上调NRK-52E中α-SMA、FN、galectin-3、Snail、KIM-1的表达,以及TIMP1与MMP9、P-Akt与Akt、P-GSK-3β与GSK-3β的比值,显著下调E-cadherin的表达.SF-MSCs-CM显著增加E-cadherin的表达,显著降低上述其他表达.无论是Gal-3 KD NRK-52E还是Gal-3 OE NRK-52E,SF-MSCs-CM干预组均表现出类似的作用趋势,而SF-MSCs-CM对Gal-3 KD NRK-52E的抗纤维化作用较Gal-3 OE NRK-52E更为明显.结论:SF-MSCs-CM可能通过抑制galectin-3/Akt/GSK-3β/Snail信号通路抑制EMT产生,改善TGF-β1诱导的肾纤维化.Galectin-3可能是一个有潜在临床价值的抗纤靶点.

骨髓源性间充质干细胞通过抑制Galectin-3/Akt/mTOR信号通路改善TGF-β1诱导的NRK-52E细胞纤维化

目的:探索无血清骨髓源性间充质干细胞(MSCs)条件培养基,在拮抗TGF-β1诱导的大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E)纤维化的过程中,是否经galectin-3基因调控自噬而发挥抗纤维化作用.方法:无菌条件下从年轻SD大鼠股骨和胫骨骨髓中提取骨髓MSCs进行原代培养,收集P3代细胞的无血清培养基离心过滤,制备MSCs条件培养上清(SF-MSCs-CM)备用.用含10%FBS的低糖DMEM培养正常的大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E),并将其分为5组:正常组,TGF-β1组,TGF-β1+SF-MSCs-CM干预组,TGF-β1+SF-DMEM(无血清低糖DMEM)干预组以及SF-MSCs-CM组.用人重组TGF-β1(15ng/mL)处理NRK-52E细胞72h,建立纤维化模型,建模后的干预分别用SF-MSCs-CM和SF-DMEM处理24h,SF-MSCs-CM组仅加SF-MSCs-CM处理24 h.利用慢病毒载体转染NRK-52E细胞,建立galectin-3敲低(Gal-3 KD)和galectin-3过表达(Gal-3 OE)工具细胞,分组及处理同前.采用免疫印迹法和免疫细胞化学法检测纤维化及自噬相关指标.结果:TGF-β1明显上调NRK-52E中α-SMA、FN、galectin-3的表达,以及P-PI3K/PI3K、P-Akt/Akt、P-mTOR/mTOR、LC3B-Ⅱ/Ⅰ的比值,显著下调P62的表达.SF-MSCs-CM显著增加LC3B-Ⅱ/Ⅰ的表达,而降低上述其他指标的表达.无论是Gal-3 KD NRK-52E还是Gal-3 OE NRK-52E,SF-MSCs-CM干预组也表现出类似的趋势,而SF-MSCs-CM对Gal-3 KD NRK-52E的抗纤和增强自噬较Gal-3 OE NRK-52E更为明显.结论:SF-MSCs-CM可能通过抑制galectin-3/Akt/mTOR信号通路增强自噬,从而改善TGF-β1诱导的纤维化.galectin-3可能是一个具有潜在价值的抗纤靶点.