四川地区一株PCV2的分离鉴定及基因组序列分析

为了解猪圆环病毒2型(PCV2)当前流行分离株的基因型和进化特征,本研究对PCV2阳性临床样品进行分离鉴定,并对分离毒株进行全基因组序列扩增、测序及遗传进化分析,利用MegAlign7.0和DNAstar软件对分离株ORF2基因编码的Cap蛋白进行氨基酸变异分析和抗原指数预测分析。测序结果显示,PCV2分离株(SMU-2022)的全基因组序列长度为1 767 nt。全基因组和Cap蛋白的遗传进化树结果均显示分离株属于PCV2d基因型,与国内外46株参考毒株的相似性在91.8%~99.1%之间,其中与QZ1410毒株的相似性最高,亲缘关系最接近。关键氨基酸位点变异分析表明,在Cap蛋白上有2个氨基酸特异性突变位点,分别是V30L和T232K。抗原指数分析发现,分离株的Cap蛋白抗原指数与4株疫苗株相比差异较大,主要集中在第20-30、40-75、90-100、130-140、195-205、210-220位氨基酸这6个区域。

反刍动物溶血性曼氏杆菌病的诊断与防控

溶血性曼氏杆菌常存在于牛、羊等反刍动物的上呼吸道中,正常情况下不易导致动物发病,为条件性致病菌,但在应激因素影响下,如气候变化、长途运输或者存在病毒、支原体、多杀性巴氏杆菌混合感染导致免疫力降低时,可引起牛地方流行性肺炎、奶牛急性胸膜肺炎、犊牛多发性血管炎、山羊肺炎、绵羊乳房炎和羔羊急性败血症等多种疾病,且其引发乳房炎的能力可能强于金黄色葡萄球菌。

SOCS2对山羊鼻甲骨细胞增殖、周期及凋亡的影响

细胞因子信号转导抑制因子2 (suppressor of cytokine signaling 2,SOCS2)在动物体内参与调节多种生理和病理过程,如细胞凋亡、细胞增殖、细胞周期、肿瘤和炎症反应等。本研究在首次克隆山羊SOCS2基因的基础上,研究过表达和干扰SOCS2表达对山羊鼻甲骨细胞增殖、周期及凋亡的影响。以1周岁的健康简州大耳羊(6只)的心、肝、脾、肺、肾、瘤胃、大肠、小肠和山羊鼻甲骨细胞共9个样本为模板,采用反转录PCR技术克隆山羊SOCS2基因CDS区序列,并进行序列分析。利用RT-qPCR技术检测SOCS2基因在不同组织中的表达。将克隆得到的SOCS2基因CDS区连接载体构建真核表达载体pcDNA3.1-SOCS2。根据山羊SOCS2基因序列设计合成并筛选有效siRNA。利用Lipofectamine^(TM) 3000试剂将pcDNA3.1-SOCS2和siRNA片段分别转染至鼻甲骨细胞,采用蛋白免疫印迹技术检测SOCS2蛋白表达,MTT法检测SOCS2对细胞增殖的影响,流式细胞术检测SOCS2对细胞周期和凋亡的影响,并利用RT-qPCR技术检测细胞周期相关基因p21、CDK2和凋亡相关基因Caspase3、Caspase7、PARP1、p53、Bax、BCL2L11和Bcl-2的转录水平。结果显示,成功扩增山羊SOCS2基因序列,总长为1 065 bp, CDS区长为597 bp,编码198个氨基酸残基。SOCS2基因在肝中表达水平最高;SOCS2可以抑制细胞增殖。成功构建真核表达载体pcDNA3.1-SOCS2,且该基因在鼻甲骨细胞内成功表达。SOCS2过表达可导致G2/M+S期细胞数量显著增加,且下调CDK2和p21基因的mRNA表达;促进细胞凋亡,且上调Caspase3、Caspase7、Bax、p53、BCL2L11、Bcl-2基因的mRNA表达,PARP1表达水平无显著变化。而干扰SOCS2表达后,G0/G1期细胞数量显著升高,且CDK2和p21基因的mRNA表达上调;细胞凋亡被抑制,且Caspase3、Bax、p53、PARP1基因的mRNA表达下调,Caspase7、BCL2L11、Bcl-2基因表达水平无显著变化。综上所述,SOCS2可将细胞周期阻滞在G2/M+S期,促进细胞凋亡,抑制细胞增殖。研究结果为全面揭示山羊SOCS2功能提供试验数据。

蛋内注射硒和维生素E对1日龄肉鸡抗氧化性能和免疫性能的影响

为研究胚蛋内注射硒和维生素E对1日龄肉鸡抗氧化性能和免疫性能的影响,试验选取240枚重量相近的黄羽肉鸡种蛋,随机分为4组:对照组(生理盐水)、硒组(20 mg硒/枚)、维生素E组(5 mg维生素E/枚)和混合组(20 mg硒+5 mg维生素E/枚),孵化至10胚龄时,于胚蛋卵黄囊内注射四种不同物质,统计出雏情况并检测1日龄肉鸡相关指标.结果显示,与对照组相比,混合注射硒和维生素E显著增加了1日龄肉鸡胸肌指数和肝指数(P<0.05),三个试验组均显著增加了脾指数(P<0.05);维生素E组血清过氧化氢酶(CAT)、硒组血清谷胱甘肽过氧化物酶(GSH⁃Px)和混合组血清CAT、GSH⁃Px、超氧化物歧化酶(SOD)的活性显著升高(P<0.05);在肝中,维生素E组GSH⁃Px和硒组SOD活性显著升高(P<0.05);维生素E组肝CAT、SOD、GSH⁃Px、核因子红细胞系2相关因子2(Nrf2)、肿瘤坏死因子⁃α(TNF⁃α)和干扰素⁃γ(IFN⁃γ)等基因表达显著上调(P<0.05),混合组肝CAT、Nrf2和白细胞介素⁃1β(IL⁃1β)的基因表达显著上调(P<0.05).结果表明,蛋内注射硒和维生素E显著提高了1日龄肉鸡的抗氧化和免疫性能,并促进了雏鸡组织器官的生长发育,硒和维生素E联合注射效果优于单独注射.该研究为硒和维生素E在早期应用于鸡胚,从而提高雏鸡的抗氧化和免疫性能提供了科学理论依据.

构建过表达TRPV1基因的Caco-2细胞株

采用慢病毒载体系统构建辣椒素受体基因TRPV1过表达的人结直肠腺癌细胞Caco-2稳定重组株.将双酶切后的慢病毒空载体pCDH和TRPV1全基因PCR产物通过T4 DNA Ligase连接,构建包含TRPV1基因的过表达载体pCDH-TRPV1.将过表达载体pCDH-TRPV1转化DH 5α感受态细菌,大量扩繁后提取过表达载体pCDH-TRPV1的质粒,与psPAX2和pMD两种含有慢病毒包装所必需元件的质粒混合,再与脂质体混合制备脂质体-载体混合液.将脂质体-载体混合液转染至单层的293T细胞中,培养48h进行病毒包装.收集富含慢病毒颗粒的293T细胞上清液,超离心纯化成浓缩病毒,然后再与polybrene一起感染单层Caco-2细胞,通过GFP绿荧光信号来筛选获得TRPV1基因过表达的稳定细胞株.通过Realtime PCR方法和Western-blot检测TRPV1的mRNA表达量及蛋白表达量,结果表明,Caco-2-TRPV1重组细胞株的TRPV1的mRNA表达量及蛋白表达量均显著高于Caco-2-GFP对照细胞(P<0.05).成功构建了TRPV1基因过表达的稳定细胞株,为后续辣椒素降脂机理的研究提供了正向调控细胞模型.

饲粮中添加酶制剂和抗菌肽对藏鸡肠道内源酶活性的影响

试验旨在探究饲粮中添加非淀粉多糖(Non-starch polysaccharides,NSP)复合酶制剂、抗菌肽及酶肽复合剂对21~63日龄藏鸡小肠内源酶活性的影响。选取体重相近的14日龄藏鸡240只,随机分为4组,即基础饲粮组(对照组)、酶制剂组、抗菌肽组和酶肽复合组。预饲7天,42、63日龄采集藏鸡十二指肠、空肠、回肠肠道内容物,检测各组食糜中α-淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶及糜蛋白酶活性。结果显示,与对照组相比,在42日龄时,酶肽复合添加显著提高了藏鸡小肠α-淀粉酶、糜蛋白酶活性及十二指肠和回肠脂肪酶活性(P<0.05);酶制剂显著提高了藏鸡十二指肠、回肠α-淀粉酶活性和空肠、回肠脂肪酶活性(P<0.05);在63日龄时,酶肽复合添加显著提高了藏鸡小肠糜蛋白酶活性,显著提高了十二指肠和回肠α-淀粉酶活性及十二指肠、空肠脂肪酶活性(P<0.05);酶制剂显著提高了藏鸡小肠脂肪酶活性及十二指肠、回肠α-淀粉酶活性(P<0.05);而抗菌肽对藏鸡小肠内源酶活性无显著影响(P>0.05)。结果表明,酶制剂单独添加及酶制剂和抗菌肽联合添加均能显著增强藏鸡小肠内源酶活性,且联合添加效果优于酶制剂单独添加。

工程益生菌的研究进展

工程益生菌是基因编辑技术创造出的一种新型微生物,是对原有益生菌性能的改良。随着基因编辑工具的不断发展和技术的进步,益生菌的工程改造正变得越来越多样化。本文主要论述近年来工程益生菌的构建方法,基因重组技术在工程益生菌中的应用,工程益生菌在疾病防治方面的应用进展,以期为新型工程益生菌的构建提供参考。

羊口疮、小反刍兽疫、羊痘病毒三重TaqMan荧光定量PCR方法的建立及应用

为建立一种羊口疮病毒(ORFV)、山羊痘病毒(GTPV)、小反刍兽疫病毒(PPRV)三种病原的联合共检方法,以ORFV、GTPV和PPRV基因序列为模板,克隆得ORFV-B2L、GTPV-p32、PPRV-N基因序列,并构建三种病原核酸标准品,设计三对探针,建立ORFV、GTPV和PPRV三重TaqMan荧光定量PCR方法,然后对方法的检测条件进行优化及质量评价,并作临床初步验证。结果显示:所建立的ORFV、GTPV和PPRV三重TaqMan荧光定量PCR方法的特异性好,ORFV、PPRV和GTPV最低检测限值分别为2.98×101、3.81×101、6.68×10^(1)copies/μL;稳定性好,与商品化检测试剂盒和OIE标准相比具有较高的检测符合率;对279份临床样本作检测,ORFV、PPRV和GTPV的阳性检出率分别为34%、4.3%、2.5%,ORFV和GTPV的混合感染率为2.5%。

检测鹅细小病毒的恒温隔绝式荧光PCR方法的建立及初步应用

鹅细小病毒(GPV)是一种主要侵害雏鹅和雏番鸭的病原,给养禽业带来了巨大的经济损失.利用GPV的VP3基因保守区域设计了一对引物和探针,经反应体系的优化,建立检测鹅细小病毒的恒温隔绝式荧光PCR方法(ii PCR方法),并与TaqMan荧光定量PCR方法比较.结果显示,该方法能特异性检出GPV,对其他常见无关病原不检出,特异性好;检测下限是38.1拷贝·μL-1,灵敏度高;批内、批间变异系数均小于5%,重复性好;该方法对31份临床疑似样本的检出率为93.54%,高于TaqMan荧光定量PCR方法的检出率(83.87%).本研究为鹅细小病毒的现场快速检测提供了新的技术手段.

一株藏猪源奇异变形杆菌的分离鉴定及药敏试验

本研究从某藏猪场发病仔猪病料中分离细菌,对分离菌进行形态学、染色特性、生化特性鉴定,并分析16S rDNA基因同源性,同时进行了药敏试验。分离鉴定结果得出:分离菌呈多形性,多为革兰氏阴性短杆菌,少数为长杆状,在SS培养基上形成中心黑色、边缘白色的单菌落;生化反应对鸟氨酸脱羧酶、尿素酶、葡萄糖、柠檬酸盐、山梨醇、硫化氢等呈阳性反应;分离株16S rDNA基因的PCR扩增目的条带约为1410 bp,在GenBank上进行同源性比对,与奇异变形杆菌的相似度为99%。从形态学、生化特性和16S rDNA序列分析结果鉴定出所分离的菌株为奇异变形杆菌。药敏试验结果显示:菌株的耐药性很强,只对头孢他啶、氧氟沙星、庆大霉素、阿米卡星、氟苯尼考、左氧氟沙星、麦迪霉素等敏感。

基因C型鸭甲肝病毒竞争ELISA抗体检测方法的建立

为建立检测基因C型鸭甲肝病毒（DHAV-C）血清抗体的方法,本研究以纯化的DHAV-C作为包被抗原,抗DHAV-C单克隆抗体（MAb）5E3-9与待检血清竞争结合抗原,采用方阵法确定包被抗原、MAb及待检血清的最佳工作浓度,经过对反应条件的优化,建立了DHAV-C抗体的竞争ELISA检测方法。该方法仅对DHAV-C血清检测为阳性,与DHAV-A、鸭圆环病毒、鸭乙型肝炎病毒等相关病原的鸭阳性血清无交叉反应。敏感性试验表明,标准阳性血清1：128倍稀释时,检测结果仍为阳性,比中和试验灵敏性更高。批内批间变异系数分别为4.64%~5.21%和6.02%~8.68%,具有良好的重复性。与中和试验比较,阳性符合率为100%（15/15）,阴性符合率为77.8%（14/18）。本研究基于纯化的DHAV-C及其特异性MAb建立的MAb竞争ELISA检测方法可以用于DHAV-C流行病学调查以及抗体的检测。

基因C型鸭甲肝病毒单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定

为制备基因C型鸭甲肝病毒(DHAV-C)单克隆抗体(MAb),本研究根据DHAV-C ORF编码氨基酸序列与基因A型DHAV(DHAV-A)相应序列比对结果,利用生物信息学软件筛选位于DHAV-C ORF编码蛋白序列上的不同抗原表位,合成5条十肽表位序列,分别与KLH载体蛋白偶联后免疫BALB/c小鼠,经细胞融合筛选获得5株稳定分泌抗DHAV-C MAb杂交瘤细胞株。Western blot显示,5株MAb均能够与DHAV-C发生特异性反应,其中5H24-9、3E18-4和5E3-9 3株MAb不与DHAV-A、鸭瘟病毒、新城疫病毒和禽流感病毒反应,为DHAV-C的特异性MAb,同时也证明与这3株MAb结合的十肽序列为DHAV-C的抗原表位。这3株MAb亚类分别为IgG2b、IgG1和IgG2b。MAb的制备为建立DHAV-C的检测方法和致病机理奠定了基础。

新生山羊睾丸支持细胞分离培养方法研究

为了比较不同培养方式获得新生山羊睾丸支持细胞的效果,试验分别采用0.125%胰蛋白酶、1.3 mg/mL胶原酶Ⅰ消化法及组织块法分离培养细胞,并对分离纯化的细胞分别进行吖啶橙(AO)染色,观察细胞形态,利用Feulgen染色试剂盒对其进行鉴定,绘制细胞生长曲线,通过脂质体介导法将绿色荧光蛋白(EGFP)转入睾丸支持细胞并在荧光倒置显微镜下检测该蛋白的表达情况。结果表明:相较于胶原酶Ⅰ消化法和组织块法,0.125%胰蛋白酶消化法获得的睾丸支持细胞数量较多,细胞生长快,成本较低,可连续传至第35代;分离纯化的细胞经吖啶橙染色,细胞呈不规则的多边形,细胞核为绿色;Feulgen染色试剂盒鉴定可见细胞核淡染,细胞质不着色,细胞界限清晰,细胞核内有大小不一的颗粒状物质,为细胞核仁周围的卫星核小体;加入MTT培养至第5天时睾丸支持细胞的活力最强,可用于后续试验;质粒pEGFP-N1成功导入睾丸支持细胞内,荧光倒置显微镜下可见部分细胞发绿色荧光。说明低浓度胰蛋白酶消化法是一种培养时间短、成本低、操作可行性好的分离山羊睾丸支持细胞的方法。