小鼠胚胎干细胞NT3基因转染后移植对脊髓损伤的恢复作用

目的：由胚胎干细胞分化的神经细胞移植能够在一定程度上恢复脊髓损伤模型动物的功能,此发现使胚胎干细胞成为一种用于移植学研究的重要工具。观察经NT3基因转染修饰的小鼠MESPU35（ES-NT3）胚胎干细胞株移植对脊髓损伤动物脊髓结构和功能重建的恢复效果。方法：实验于2004-09/12在解放军第三军医大学组织胚胎学教研室实验室完成。①材料：清洁级成年Wistar大鼠36只,随机数字表法分为模型对照组、未转染细胞移植组、基因转染细胞移植组,12只/组,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。移植所用MESPU35细胞株和ES-NT3细胞株均由本室冻存。②实验方法：复苏MESPU35和ES-NT3细胞株,采用经典维甲酸4-/4＋法诱导两种胚胎干细胞神经定向分化,收集分化9d后的细胞,调整细胞终浓度至5×10^10L^-1备用。各组大鼠均建立L4脊髓损伤模型,在脊髓完全横断后10min内,基因转染细胞移植组分多点缓慢注入ES-NT3胚胎干细胞悬液,2μL/点,细胞总数约4×10^5个,注射位置为损伤区域白质与灰质交界处;未转染细胞移植组同法注射MESPU35胚胎干细胞悬液,模型对照组注射等量生理盐水。③实验评估：各组大鼠分别于术前、术后即刻、术后15d和30d进行后肢运动功能Tarlov评分检测,分数越低表示运动功能恢复越差。后肢运动功能检测30min后进行斜板实验,检测大鼠抓握和维持姿势能力。微型注射器将25%的辣根过氧化物酶2μL注入大鼠坐骨神经内,2d后取L1～L4脊髓常规冰冻切片,参照Mesulam法进行过氧化物酶逆行追踪。结果：因细菌感染,模型对照组、未转染细胞移植组、基因转染细胞移植组各死亡2只、1只、2只。①后肢运动功能检测：各组大鼠术后即刻后肢运动功能评分为0。术后15d,30d与模型对照组比较,未转染细胞移植组后肢运动功能评分升高（P〈0.01）,但未达到正常水平;基因转染细胞移植组恢复程度最高,后肢运动功能评分基本接近正常水平,明显高于未转染细胞移植组（P〈0.05）。②斜板试验：与后肢运动功能检测结果基本相似。③辣根过氧化物酶逆行追踪情况：模型对照组未见阳性神经元。术后30d基因转染细胞移植组阳性神经元增至最多,脊髓结构恢复情况优于未转染细胞移植组。结论：经NT3基因转染修饰的鼠MESPU35胚胎干细胞向神经定向诱导分化后,移植治疗脊髓损伤大鼠能更好地促进脊髓功能恢复和结构重建。

γ射线预处理制备胚胎干细胞滋养层的实验研究

目的筛选并建立稳定、高效的胚胎干细胞滋养层细胞体外培养的最佳条件,利于胚胎干细胞的培养。方法清洁级昆明系孕12.5天、14.5天、18.5天雌鼠和新生(P0)昆明小鼠各5只。无菌取上述各孕龄小鼠胚胎分离培养原代鼠胚成纤维细胞(MEF)并传代;以60Coγ射线(30Gy,20℃)分别照射10、20、25min后制备滋养层细胞。结果胚龄及60Coγ射线照射对MEF的细胞活性、生长增生和分泌功能有影响。(1)细胞活性状态:①E12.5天、E14.5天、E18天鼠胚和P0来源的第3～5代MEF活性均较好。E18.5天鼠胚和P0来源的第6代MEF,后期深染变形细胞的比例增多达32%,与E14.5天鼠胚来源同代细胞相比有显著差异(P<0.05);②E14.5天来源的第3～6代细胞采用60Coγ射线照射10min组,细胞仍生长迅速。照射20min组,细胞可维持存活达20天以上,细胞密度无显著变化。照射25min组,细胞存活14天左右且细胞密度无显著增加。(2)细胞分泌功能:①E14.5天鼠胚来源的第3～6代MEF以及用60Coγ射线照射10min组和20min组并培养5天时均可见较多数目的Ⅰ型胶原蛋白免疫阳性细胞,且染色较深;②60Coγ射线照射25min组,培养5天后第3～4代MEF中Ⅰ型胶原蛋白阳性细胞数目与正常组相比无明显差异;但第5代后MEF中Ⅰ型胶原蛋白阳性细胞数目减少,染色浅淡。结论 E14.5天鼠胚来源的第3～6代是用于制备滋养层的最佳来源;60Coγ射线(30Gy,20℃)照射20min可作为预处理制备滋养层细胞的最佳条件。

神经干细胞移植促进脊髓损伤大鼠脊髓功能的恢复

目的:观察神经干细胞移植对脊髓损伤大鼠功能恢复的作用。方法:30只Wistar大鼠随机分为对照组、损伤组和移植组,每组10只;损伤组和移植组制作成平面的脊髓全横断模型,将培养的大鼠L4NSCs悬液注入移植组损伤脊髓处,损伤组注射等量的生理盐水。术后个2月,采用BBB评分、皮层体感诱发电位CSEP和辣根过氧化物酶()()逆行示踪技术观察大鼠脊髓运动和传导功能的恢复程度。HRP结果:术后个月2BBB评分损伤组、移植组大鼠有所恢复,但都未达到正常水平,其中移植组的大鼠恢复较好,评分较高,与损伤组有显著性差异。脊髓损伤后,损伤组、移植组的CSEP波消失,术后2个月移植组的波形有所恢复,但潜伏期延长。对照组脊髓前角可见到许多HRP标记阳性神经元,损伤组未见阳性神经元,移植组可见有阳性神经元,但数目较对照组少。结论:NSCs脊髓内移植能促进损伤脊髓运动和传导功能的部分恢复。

肾母细胞瘤过度表达基因促进人神经干细胞增殖和向神经元分化的实验观察(英文)

背景:肾母细胞瘤过度表达基因(NOV)编码的NOV蛋白是一种胰岛素样生长因子(insulin-likegrowthfactor,IGF)结合蛋白,它对人神经干细胞的增殖和分化有什么影响作用呢?目的:探讨NOV蛋白对人神经干细胞(HNSCs)增殖和分化的影响。设计:以细胞为研究对象,单因素方差分析实验研究。单位:一所军医大学组织学与胚胎学教研室和神经生物学教研室。材料:实验在解放军第三军医大学组织学与胚胎学教研室完成。对象为10～14周人胚大脑皮质培养的HNSCs。干预:NOV基因重组质粒转染COS-7细胞,收集COS-7细胞和NOV基因修饰COS-7细胞的条件培养液(COS-CM和NOV-CM),作用于培养的HNSCs。主要观察指标:3H-TdR掺入液闪检测HNSCs的增殖,免疫细胞化学和流式细胞仪检测HNSCs的分化。结果:COS-CM和NOV-CM均能明显促进HNSCs对3H-TdR的摄入,其中NOV-CM组的1/min比COS-CM组要高(P<0.05),说明NOV-CM中含有促进HNSCs增殖的成分,另外NOV-CM的促细胞增殖作用具有一定的量效关系;免疫细胞化学和流式细胞仪结果显示,在NOV-CM组内有较多的NF-200阳性细胞,在对照组和COS-CM组可见到大量GFAP阳性细胞。结论:NOV蛋白可能具有促进HNSCs增殖和向神经元分化的作用。