成纤维细胞生长因子Ⅱ型受体基因突变对小鼠骨髓基质细胞发育的影响

目的:观察对比野生型小鼠和成纤维细胞生长因子Ⅱ型受体突变型小鼠骨髓基质细胞体外培养的生长情况以及成骨潜能,探讨成纤维细胞生长因子Ⅱ型受体功能持续增强对小鼠骨髓基质细胞发育的影响。方法:实验于2005-09/2006-02在解放军第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所创伤中心实验室,创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室完成。①实验动物:将雄性成纤维细胞生长因子Ⅱ型受体S252W突变小鼠(由陈林教授在美国国立卫生研究院建立后引入本实验室)和雌性C57BL/6J小鼠(由解放军第三军医大学大坪医院实验动物中心提供)交配,经过基因型鉴定的雄性F1代8周龄小鼠按照基因型分为野生型组和突变型组,12只/组。②实验方法:将两组小鼠脱臼处死后分离胫、股骨,用DMEM培养液冲出骨髓,离心后弃上清,加入DMEM低糖培养液制成细胞悬液,贴壁法分离培养骨髓基质细胞,以1×108 L-1密度传代。③实验评估:倒置相差显微镜下观察细胞形态及贴壁生长情况。采用MTT法检测两组骨髓基质细胞的增殖情况。检测体外成骨诱导条件下两组骨髓基质细胞的碱性磷酸酶活性。采用Vankossa染色检测体外成骨诱导条件下两组骨髓基质细胞的钙结节形成能力。结果:①形态学观察:倒置相差显微镜下两组骨髓基质细胞形态变化相似。第3代骨髓基质细胞在体外诱导成骨条件下增殖速度明显减慢,多数细胞由梭形变成长方形,并逐渐成为立方形,细胞体积增大。②生长曲线:野生型组骨髓基质细胞的吸光度值在接种后2d内变化不大,细胞处于潜伏期,第4天显著增加,第6天达高峰,进入平台期。与野生型组比较,突变型组骨髓基质细胞生长曲线出现右移和平台期滞后。③碱性磷酸酶活性:在体外诱导成骨条件下,野生型组骨髓基质细胞随培养时间延长碱性磷酸酶活性逐渐上升,第9～15天达高峰,然后随细胞老化而下降。与野生型组相比较,突变型组骨髓基质细胞碱性磷酸酶活性增高出现滞后现象,并且其高峰数值显著低于野生型组(P<0.05)。④钙结节形成:经过21d的成骨诱导培养,野生型组骨髓基质细胞可见较多的钙结节形成,突变型组有分散的钙结节形成,但较细小。结论:成纤维细胞生长因子及其受体信号对细胞发育的调控效应是复杂多面的,持续的成纤维细胞生长因子Ⅱ型受体功能增强可能引起体外培养的小鼠骨髓基质细胞增生减缓,并可能阻抑其向成骨细胞的分化。