贵阳地区224例哮喘儿童IL-17A-152G/A位点基因多态性及与哮喘易感性的研究

目的:探讨白细胞介素-17A(IL-17A)-152G/A位点单核苷酸多态性(SNP)在贵阳地区支气管哮喘儿童的分布特征。方法:选择224例支气管哮喘患儿作为哮喘组,对照组为同期150例健康体检儿童,采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法检测两组IL-17A-152G/A位点单核苷酸多态性,分析两组基因型、等位基因频率及其与哮喘易感性的关系,采用χ2检验分析基因型及等位基因频率。结果:IL-17A基因-152G/A位点AA、AG、GG 3种基因型频率在哮喘组中分别为21.4%、53.6%、25.0%,对照组中分别为11.3%、54.7%、34.0%,该位点在哮喘组与对照组间基因型频率及等位基因频率分布差异均有统计学意义(χ2=7.832,P<0.05;χ2=6.635,P<0.05),等位基因A与哮喘相关。结论:IL-17A基因-152G/A位点多态性可能是贵阳地区儿童支气管哮喘的候选基因,AA纯合子基因型可能与儿童支气管哮喘发病相关。

Irx5a在野生型斑马鱼早期发育中的表达

目的:观测Irx5a基因在Tuebingen野生型斑马鱼胚胎发育过程中的表达。方法:利用Trizol法提取斑马鱼胚胎的总RNA,应用RT-PCR方法扩增Irx5a基因,将其克隆入pCS^(2+)质粒中,经菌落PCR、双酶切法及DNA测序鉴定正确后,利用体外转录体系制备Irx5a的反义mRNA探针;用该反义mRNA探针进行斑马鱼全胚胎原位杂交。结果:构建和鉴定了Irx5a-pCS^(2+)重组质粒,经斑马鱼全胚胎原位杂交检测Irx5a基因的表达,发现从3.7 hpf开始有表达,并且在胚胎神经系统和造血系统都有明显表达。结论:Irx5a基因可能参与了Tuebingen野生型斑马鱼胚胎发育早期的神经系统和造血系统的发育。

长春碱增加班马鱼肿瘤耐药基因abcb4的表达

目的通过研究长春碱(VBL)对斑马鱼早期发育过程中abcb4肿瘤耐药基因表达的影响,为进一步建立抗肿瘤药物多药耐药筛选的斑马鱼模型奠定重要的实验基础。方法将长春碱稀释成不同浓度梯度的药液,在受精后0.5~1.5 h的斑马鱼胚胎上完成药物暴露实验,计算出长春碱IC_(50)的数值。设置长春碱为实验组,胚胎培养液为空白对照组,分别作用于受精后0.5~1.5 h的斑马鱼胚胎,观察受精后24~120 h的斑马鱼胚胎发育情况,记录死亡、孵化及畸形的胚胎数目;收集不同组别的斑马鱼胚胎,通过实时荧光定量PCR和胚胎整体原位杂交的方法,检测斑马鱼胚胎中abcb4基因的表达量。结果计算出长春碱在斑马鱼胚胎中的IC_(50)为3.08μmol/L;与对照组比较,实验组的斑马鱼胚胎abcb4基因的mRNA水平明显升高(P<0.05);通过胚胎整体原位杂交的方法,在受精后120 h斑马鱼胚胎的小肠部位发现有abcb4基因阳性杂交信号,且实验组斑马鱼胚胎在脑和心脏部位发现abcb4基因阳性杂交信号。结论长春碱能明显增加斑马鱼早期胚胎中abcb4肿瘤耐药基因的表达水平,提示使用斑马鱼可以复制肿瘤耐药模型。

1-萘酚胚胎期暴露对斑马鱼发育的毒性作用

目的探讨1-萘酚(1-NAP)胚胎期暴露对斑马鱼发育的毒性作用,并对其可能的机制进行研究。方法挑选斑马鱼受精卵,在受精后24 h(hours post fertilization,hpf)进行不同浓度(0、40、80、160、200μmol/L)1-NAP暴露处理,观察并记录其处理至斑马鱼120 hpf时的畸形数和死亡数,计算畸形率、孵化率及半数致死浓度(IC50)。设置空白对照组,N-乙酰半胱氨酸(NAC)处理组,1-NAP处理组,NAC预处理组,检测幼鱼体内活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)、还原型谷胱甘肽(GSH)和总巯基(-SH)含量以及超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性;通过Western blot法检测胚胎凋亡蛋白Caspase3、Bax的表达情况。结果计算出1-NAP在斑马鱼胚胎的IC50为111.31μmol/L,斑马鱼胚胎期暴露于高浓度1-萘酚(>80μmol/L)导致死亡率和畸形率明显增加,孵化率明显降低,表现出发育毒性;50μmol/L浓度1-NAP处理组ROS、MDA含量明显升高,GSH、-SH水平明显降低,抗氧化酶CAT、SOD的活性受到抑制(P<0.001);胚胎凋亡蛋白Caspase3、Bax表达量增加;NAC(0.5 mmol/L)预处理组斑马鱼胚胎的畸形率明显降低,ROS、MDA含量明显减少,GSH、-SH含量以及SOD、CAT活性有所恢复,凋亡蛋白Caspase3、Bax表达量明显降低。结论 1-萘酚胚胎期暴露对斑马鱼发育的毒性作用可能与1-萘酚诱导的氧化应激相关。

g6pd基因在野生型斑马鱼胚胎发育过程中的表达

目的:观察g6pd基因在野生型斑马鱼胚胎早期发育过程中的表达情况。方法:利用基因数据库和BLAST软件分别进行g6pd基因的共线性分析和G6pd蛋白质序列相似性分析。原位杂交技术观察不同时相斑马鱼胚胎中g6pd基因的表达;构建g6pd-EGFP-pCS^(2+)重组质粒,并将其显微注射入斑马鱼胚胎内,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达;蛋白质印迹法检测24、48、72 hpf斑马鱼胚胎中G6pd蛋白的表达量;改良G6pd定量比值法检测24、48、72 hpf斑马鱼胚胎中G6pd酶活性。结果:g6pd基因在进化过程中相对保守,斑马鱼与人类的G6pd蛋白质相似度为88%,斑马鱼与小鼠的G6pd蛋白质相似度为87%。原位杂交试验结果显示,g6pd基因主要表达于斑马鱼的造血组织,显微注射g6pd-EGFP-p CS2+重组质粒后观察的结果与原位杂交试验结果一致。24、48、72 hpf斑马鱼胚胎中G6pd蛋白相对表达量分别为1.44±0.03、1.47±0.05、1.54±0.02,差异无统计学意义(P>0.05);G6pd酶活性分别为1.74±0.17、1.75±0.12、1.71±0.22,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:成功观察到斑马鱼体内g6pd基因表达部位及其变化规律,并测定了不同发育时相斑马鱼胚胎中G6pd蛋白表达和酶活性,为建立斑马鱼G6PD缺乏症模型奠定了基础。

hoxb4转基因斑马鱼造血发育中rap1b基因的表达

目的为了发现在早期造血发育中关键的调控因子,利用hoxb4转基因斑马鱼研究rap1b基因的表达变化情况,以期明确hoxb4与rap1b在早期造血发育中的关系。方法选取过表达hoxb4的斑马鱼系为研究对象,分为3组:实验组(表达hoxb4-EGFP的斑马鱼),实验对照组(表达EGFP的斑马鱼),空白对照组(野生型斑马鱼)。通过流式分选技术将实验对照组和实验组18hpf(斑马鱼胚胎受精发育18 h)、24、30、36、48hpf胚胎中带有绿色荧光(enhanced green fluorescent protein,EGFP)信号的细胞分选出来,利用实时荧光定量PCR检测分选出的细胞中的rap1b基因的表达变化;然后收集野生型斑马鱼多时相胚胎,制备rap1b基因的反义m RNA探针,通过胚胎原位杂交观察探针在3组斑马鱼胚胎18、24、30、36、48hpf杂交信号表达部位。结果 q RT-PCR结果显示实验组30、36、48hpf的斑马鱼胚胎的rap1b基因的表达明显增强(P<0.05);制备了rap1b基因的反义m RNA探针,胚胎整体原位杂交结果显示:rap1b基因在3组斑马鱼胚胎18~48hpf之间神经发育和造血发育部位都有表达。结论在过表达hoxb4转基因斑马鱼中rap1b基因表达有明显的升高趋势,提示rap1b基因与hoxb4基因可能共同参与调节早期造血发育过程。

新疾病模式生物斑马鱼G6 PD酶活性的动态研究

目的:观察不同发育时期的斑马鱼胚胎、成年斑马鱼不同组织的G6PD酶活性及g6pd mRNA的表达。方法:收集受精后24 h(24 hpf)、48 hpf、受精后5 d(5 dpf)及15 dpf的野生型斑马鱼胚胎,同时收集成年斑马鱼的脑、肌肉、鳃、皮肤、眼睛及肠等组织,运用改良G6PD定量比值法和RT-PCR法检测上述胚胎或组织的G6PD酶活性及g6pd mRNA表达水平。结果:G6PD酶活性、g6pd mRNA表达水平在24 hpf、48 hpf、5 dpf及15 dpf比较,差异无统计学意义(P>0.05);在成年斑马鱼的脑、肌肉、鳃、皮肤、眼睛及肠等不同部位组织比较,差异也无统计学意义(P>0.05)。结论:野生斑马鱼G6PD酶活性、g6pd mRNA表达水平不受胚胎发育时期和组织部位的影响。

人红白血病斑马鱼异种模型的建立

目的利用斑马鱼胚胎建立人红白血病(HEL)细胞异种移植瘤模型,提供研究血液肿瘤的体内行为和实用药物测试的模型。方法将HEL细胞分为空白组和CM-DiI组,CM-DiI组用活细胞示踪剂进行标记;取野生型斑马鱼培育繁殖,产胚后将胚胎置于28℃孵育48 h至破膜,将破膜后斑马鱼分为空白对照组、PBS实验组、HEL实验组,将CM-DiI组细胞,通过显微注射方式移植到HEL实验组斑马鱼卵黄囊中,PBS实验组注射PBS,再将三组斑马鱼置于34℃温箱培养,通过体内外增殖实验及体内荧光观察等鉴定模型是否建立成功;将鉴定成功的斑马鱼进行阿糖胞苷药物暴露,分为50、100、200 nmol/L组及模型对照组,观察各组浓度药物暴露后异种移植瘤模型中白血病细胞的增殖及迁移情况。结果 CM-Dil组与空白组HEL细胞增殖状态相近,差异无统计学意义(P>0.05);通过体内外增殖实验证实了HEL细胞在斑马鱼体内出现了增殖,而HEL实验组斑马鱼存活量相对于空白对照组和PBS实验组降低(P<0.05);三个浓度的阿糖胞苷药物暴露组相对于模型对照组细胞增殖降低(P<0.05)。结论人急性红白血病HEL细胞移植入斑马鱼胚胎后可进行增殖,且增殖活动可被阿糖胞苷干预,证实异种移植瘤模型建立成功。

肺泡形成基因P311在支气管肺发育不良中的作用

目的:了解肺泡形成基因P311在支气管肺发育不良(BPD)中的作用;方法:64只早产昆明小鼠随机均分为空气组和高氧组,空气组置于室内,高氧组置于密闭的氧浓度>90%的氧舱中复制BPD动物模型;分别于造模后第1、3、7及14天取小鼠肺组织,分别采用苏木精-伊红染色观察小鼠肺组织病理改变鉴定造模是否成功,实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)法检测P311基因mRNA表达水平。结果:早产小鼠肺组织发育不成熟,高氧组随着吸氧时间的延长,小鼠表现反应迟钝、体重增长缓慢、毛发发涩无光泽、鼻尖发绀、呼吸急促,肉眼见肺组织表面有散在甚至弥漫的淤血点、小血管扩张充血,第3天镜下见肺泡腔内有炎性细胞浸润,第7天肺泡腔增大、肺间质增生,第14天肺泡腔内间质增生、少数肺泡融合、肺泡数量减少、肺泡结构简单化,说明BPD模型造模成功;第3天时2组P311基因mRNA表达量最高,随后下降;高氧组P311基因mRNA表达水平均高于同一时点空气组(P<0.05)。结论:长时间吸入高浓度氧成功构建支气管肺发育不良的动物模型,P311基因可能是影响肺损伤修复的调控因子。

p21基因在野生型斑马鱼胚胎发育过程中的表达

目的:探究p21基因在斑马鱼早期发育过程中的表达。方法:Trizol法提取野生型斑马鱼胚胎总RNA,RT-PCR法扩增p21基因片段,与p^(CS2+)载体重组构建p21-p^(CS2+)重组质粒,以T3 RNA聚合酶制备地高辛标记的反义mRNA探针,通过斑马鱼全胚胎原位杂交检测p21基因在野生型斑马鱼胚胎早期发育过程中的表达。结果:成功构建了p21-p^(CS2+)重组质粒,并制备反义mRNA探针;原位杂交结果显示野生型斑马鱼0.5~18 hpf的胚胎均未发现p21基因阳性杂交信号,24~36 hpf胚胎可在脊索部位观察到阳性信号,48~72 hpf胚胎可在头部胸腺附近观察到阳性信号,表达量均较低。结论:成功制备了p21-p^(CS2+)重组质粒及斑马鱼p21基因反义mRNA探针,p21基因在野生型斑马鱼胚胎不同发育时相中表达水平不同。

斑马鱼白血病模型的研究进展

斑马鱼是一种脊椎动物有机体,因具有保守的造血过程和独特的实验优势,尤其适合用于研究人类白血病。目前,研究斑马鱼的最新技术包括转基因技术、基因组编辑技术和移植技术,通过这些技术现已构建了许多白血病模型。斑马鱼的通体透明与先进的谱系追踪和成像技术相结合,揭示了白血病发生、发展的许多细节。凭借这些优势,斑马鱼成为白血病研究中具有独特优势的模式生物之一,此外,基于斑马鱼的高通量药物筛选的进步有望加速新型白血病疗法的开发。

Wnt/β-catenin信号通路参与化疗药物诱导的转基因斑马鱼abcb4基因的表达和耐药

目的探讨斑马鱼耐药基因ATP结合盒亚家族B成员4(ABCB4)与Wnt/β联蛋白(β-catenin)信号通路的关系。方法取野生型斑马鱼和转基因斑马鱼均设置空白对照组、阿霉素处理组、长春碱处理组、吉非替尼处理组、阿霉素联合吉非替尼处理组、长春碱联合吉非替尼处理组。每组100枚胚胎分别进行药物处理至第5天,每组取第5天斑马鱼幼鱼50枚进行实验。采用罗丹明123实验检测野生型斑马鱼耐药程度,酶标仪检测转基因的斑马鱼荧光强度,活细胞工作站检测荧光分布位置。Western blot法检测转基因的斑马鱼β-catenin、糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)、 ATP结合盒亚家族B成员4(ABCB4)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的蛋白水平。结果罗丹明123实验证实经阿霉素和长春碱药物暴露后的斑马鱼体内产生耐药, EGFP荧光强度检测结果表明经阿霉素和长春碱药物暴露后的转基因斑马鱼荧光强度高,经阿霉素和长春碱药物暴露后的转基因斑马鱼体内β-catenin的累积升高伴随着EGFP和ABCB4蛋白的增加。结论斑马鱼体内Wnt/β-catenin信号通路参与斑马鱼abcb4基因的激活与耐药。

心血管发育相关基因mpx在斑马鱼早期胚胎发育中的表达

目的:探讨斑马鱼体内髓样特异性过氧化物酶(mpx)在胚胎发育过程中的表达模式。方法:按Trizol法提取斑马鱼总RNA后逆转录成cDNA,再以cDNA为模板RT-PCR扩增mpx基因片段;用基因重组技术构建pCS2^+-mpx重组质粒后将质粒酶切线性化,T3聚合酶制备mpx反义RNA探针,用全胚胎原位杂交检测mpx基因的表达。结果:成功构建了pCS2^+-mpx重组质粒,原位杂交结果显示在24 hpf,mpx基因在斑马鱼胚胎中间细胞团表达;从24 hpf开始,mpx基因在斑马鱼胚胎卵黄囊表面、心脏和轴向脉管系统中高表达,一直持续到72 hpf;尤其是在72 hpf,mpx基因在整个胚胎头部、卵黄囊表面、尾部中弥散表达。结论:mpx基因在斑马鱼心血管系统发育的时间和部位中都有表达,mpx基因可能参与调控斑马鱼心血管系统发育。

吉非替尼对斑马鱼胚胎发育及肿瘤耐药基因表达的影响

目的研究吉非替尼对斑马鱼早期胚胎发育及abcb4肿瘤耐药基因表达的影响。方法实验动物采用斑马鱼,实验分为吉非替尼组、阿霉素和吉非替尼的混合液组、空白对照组。将吉非替尼稀释成不同浓度梯度的药液,分别处理受精后0.5~1.5h(0.5~1.5hpf)的斑马鱼胚胎,观察胚胎和幼鱼的死亡率、孵化率及畸形率变化。统计各浓度不同时间点的胚胎死亡率,计算出IC_(50)的数值;统计48hpf和72hpf的胚胎孵化率及120hpf的畸形率;收集不同组别的斑马鱼胚胎,通过实时荧光定量PCR,检测斑马鱼胚胎中abcb4基因的表达量。结果计算出吉非替尼在斑马鱼胚胎中的IC_(50)为16.18μmol/L。与对照组比较,高剂量吉非替尼(≥20μmol/L)显著抑制胚胎的孵化,并有明显的胚胎致死效应和致畸效应;吉非替尼组的斑马鱼胚胎abcb4基因的mRNA水平变化不显著,而阿霉素和吉非替尼的混合液组的abcb4基因的mRNA水平有明显变化(P<0.05)。结论吉非替尼对斑马鱼早期胚胎中abcb4肿瘤耐药基因的表达水平无明显影响(P>0.05),但是吉非替尼能逆转易耐药药物阿霉素的耐药作用,提示使用斑马鱼可以构建肿瘤耐药模型。

转基因斑马鱼模型吉非替尼抗血管生成作用研究

目的吉非替尼是第一个选择性作用于表皮生长因子受体的酪氨酸激酶,主要用于非小细胞肺癌。本研究主要探讨吉非替尼对Tg(Flk1:EGFP)转基因斑马鱼模型血管生成的影响。方法选择Tg(Flk1:EGFP)转基因斑马鱼为动物模型,分别给予10、50和100μmol/L浓度的吉非替尼干预处理。以0.025μmol/L的1-苯基-2-硫脲(1-phenyl-2-thiourea,PTU)处理组为空白对照组,以10μmol/L的SU5416处理组为阳性对照组,在受精后12h(12hours post-fertilization,12hpf)开始加药干预,用荧光显微镜观察并统计受精后30h(30hpf)的斑马鱼胚胎体节间血管的数量并计算血管抑制率。用多功能酶标仪检测受精后4d(4days post-fertilization,4dpf)的斑马鱼体内绿色荧光蛋白的表达量,并进行统计学分析。结果空白对照组斑马鱼体节间血管正常形成;10μmol/L的SU5416完全抑制了斑马鱼体节间血管的生成,血管生成抑制率为100%,10、50和100μmol/L浓度吉非替尼血管生成抑制率分别为10.4%、19.6%和26.4%,随着吉非替尼浓度的增加,血管抑制率增加(P<0.05),斑马鱼体内绿色荧光蛋白的表达量减少(P<0.05),并呈剂量依赖性。结论吉非替尼具有抑制斑马鱼血管生成的作用。吉非替尼抑制血管生成可能对其抗肿瘤治疗起一定的辅助作用。