贵州林下生态养鸡场环境的野生动物及其肠道微生物群落调查

为查明贵州林下生态养鸡场环境的生物安全状况,采用常规动物区系调查方法对具有区域代表性的贵州省毕节市威宁自治县和黔南自治州罗甸县2个林下生态养鸡环境的野生动物种类进行调查,并应用现代分子生物学技术解析野生动物肠道微生物群落结构。结果:(1)观察或捕获的林下生态养鸡场环境野生动物共计1 778只,主要是野鸟、野鼠、野兔,其中优势野生鸟类主要是灰眶雀鹛、白腰文鸟、栗耳凤鹛、红头穗鹛,野生鼠类主要是黑线姬鼠,野生兔类只有华南兔。(2)养鸡场环境野生动物肠道细菌群落丰富多样,有大肠杆菌-志贺氏菌属、梭菌属、大肠杆菌属等致病菌或条件致病菌;野生动物肠道病毒种类亦呈多样性,且存在多种可感染家禽的病毒,如细小病毒、冠状病毒、圆环病毒、疱疹病毒、痘病毒、腺病毒等。结论:贵州林下生态养鸡环境的野生动物主要是野鸟、野鼠、野兔;其肠道细菌群落主要是拟杆菌属、大肠杆菌属、梭菌属,主要病毒群落是细小病毒科、乳头瘤病毒科、二顺反子病毒科。

鸭瘟病毒的分子生物学研究进展

文章介绍了鸭瘟病毒的基因功能、蛋白功能、致病机制、免疫机制方面的研究进展情况,并提出相关研究存在的不足和需要加强研究的方向,为更加深入了解该病毒,从而开发新的治疗方法和策略提供参考。

大肠杆菌Nissle 1917鞭毛蛋白FliC的结构特性及刺激Caco-2细胞作用的研究

试验旨在分析大肠杆菌Nissle 1917鞭毛蛋白FliC(FliC_(EcN))的结构特征及其对Caco-2细胞的刺激作用。试验通过大肠杆菌BL21(DE3)表达FliCEcN蛋白、经NTA柱纯化FliC_(EcN)蛋白并通过SDS-PAGE和Westernblot验证,利用SOPMA和Alphofold2预测FliC_(EcN)蛋白的结构模型、表面增强拉曼光谱和圆二色谱解析FliC_(EcN)蛋白的结构,使用FliC_(EcN)蛋白刺激Caco-2细胞后,检测免疫相关因子的分泌水平。结果显示,FliC_(EcN)蛋白的大小为64kDa,能够被抗His单克隆抗体特异识别;FliC_(EcN)蛋白的氨基和羧基末端主要由α-螺旋组成,中间结构域主要由β-折叠组成。FliC_(EcN)蛋白酰胺Ⅰ区最大吸收峰均位于1656 cm^(-1)处,主要二级结构为α-螺旋和β-折叠;FliC_(EcN)的α-螺旋占比44.4%,β-折叠占比23.4%,β-转角占比13.5%,无规则卷曲占比19.0%;FliC_(EcN)蛋白能够有效刺激Caco-2细胞分泌白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-10(IL-10);随着刺激时间延长,IL-6的分泌水平呈下降趋势,IL-10和TNF-α的分泌水平呈增加趋势。研究表明,α-螺旋和β-折叠是构成FliC_(EcN)的主要结构,可促进其构象的正确折叠和维持其三维结构稳定,FliC_(EcN)蛋白刺激Caco-2细胞分泌IL-6、IL-10、TNF-α的水平存在差异。

复合益生菌固态发酵白酒糟条件的研究

本试验旨在探究复合益生菌固态发酵白酒糟的最优条件。选用黑曲霉、粪肠球菌、植物乳杆菌、酿酒酵母复合益生菌发酵白酒糟后,以发酵后白酒糟的粗蛋白质、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维含量和活菌数为指标,探究复合益生菌发酵白酒糟的最优基料组合。在最优发酵基料基础上,对发酵初始pH、发酵时间、发酵温度和菌种接种量进行单因素试验优化,挑选对发酵影响较大的初始pH、发酵时间和菌种接种量3个因素进行3×3正交设计,以发酵后粗蛋白质、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维含量、pH降低值为指标确定最优发酵条件。结果表明:1)在本试验条件下,复合益生菌发酵白酒糟的最优发酵基料组合为77%白酒糟+6%玉米粉+5%麸皮+12%菜籽粕。2)最优发酵条件为发酵初始pH 6、菌种接种量8%、发酵时间5 d。按照最优基料组合和最优条件发酵白酒糟,发现与优化前白酒糟相比,粗蛋白质含量提高34.46%,中性洗涤纤维含量降低35.28%,酸性洗涤纤维含量降低54.02%。而酒糟基料内菜籽粕抗营养因子硫代葡萄糖苷和植酸含量经发酵后分别降低22.92%和22.19%。综上所述,复合益生菌能有效改善白酒糟的品质,为白酒糟资源的合理利用提供理论依据。

贵州省禽白血病病毒J亚群感染的血清学检测与PCR鉴定

采用禽白血病J亚群抗体检测试剂盒对8个鸡场的血清样本进行了检测,并对出现肿瘤病变的病死鸡进行了病理组织学检查;同时采集16份禽白血病病毒J亚群(ALV-J)抗体阳性鸡的血液或肝组织,提取DNA样本进行PCR扩增,并测序分析。结果显示,4个肉种鸡场的ALV-J抗体阳性率平均为16.52%(3.33%～30.0%),而4个蛋种鸡场的ALV-J抗体阳性率均为0。病理组织学观察可见,在肝、肾、脾组织中出现大量增生的、含嗜酸性颗粒的髓细胞样瘤细胞。PCR检测发现,有14份样本扩增出ALV-J亚群特异性的病原核酸片段(545 bp),检出率达87.5%,其中在3份肝样本中同时扩增出ALV-A亚群特异性的病原核酸片段(691 bp);而ALV-J抗体阴性鸡、淋巴细胞性白血病和血管瘤型白血病的20份样本均未扩增出545 bp片段。扩增出的545 bp片段与ALV-J亚群毒株HPRS-103和ADOL-HcL的相应核苷酸序列的同源性分别达96.2%～96.8%和95.5%～96.8%。结果证实,贵州省鸡群中确实存在ALV-J亚群感染和骨髓细胞瘤病,且出现A亚群、J亚群混合感染的情况。

饲喂发酵红薯渣饲料对鲤鱼生长性能、肠道形态及非特异性免疫的影响

为探究发酵红薯渣饲料对鲤鱼生长性能、肠道形态和非特异性免疫的影响,本试验利用益生菌发酵红薯渣后,按照添加比例0%、10%、20%和30%配制饲料,即对照组、10%添加组、20%添加组和30%添加组,分别投喂初始体重为(408.36±26.12)g鲤鱼,每组3个重复,每个重复10尾,试验期为42 d,测定试验鱼的生长性能、血清抗氧化指标和非特异性免疫指标以及切片观察免疫器官与肠道结构形态。结果显示:(1)与对照组比较,10%添加组和20%添加组鲤鱼特定增长率分别提高37.45%和40.17%(P <0.05)。(2)与对照组比较,10%添加组、20%添加组和30%添加组鲤鱼肠绒毛长度、肠绒毛长度/隐窝深度(V/C)和肌层厚度均极显著增加(P <0.01)。(3)与对照组比较,20%添加组鲤鱼脾脏谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)含量显著增加27.99%(P <0.05),30%添加组鲤鱼血清丙二醛含量显著降低29.55%(P <0.05),10%添加组和30%添加组鲤鱼脾脏溶菌酶(LZM)水平均显著降低(P <0.05)。(4)与对照组比较,20%添加组脾脏IFN-γ含量分别降低25.84%(P <0.05),30%添加组鲤鱼肾脏IL-1β含量显著提高27.84%(P <0.05)。上述结果表明,发酵红薯渣能改善鲤鱼肠道形态结构,促进营养物质消化吸收和增强非特异性免疫,从而利于鲤鱼生长,其中添加20%的发酵红薯渣效果最佳。

奶牛乳房炎研究进展

奶牛乳房炎是奶牛场的常发病和难以防治的疾病,危害奶牛业的发展,是造成奶牛业经济损失的主要因素。现就奶牛乳房炎的危害、类型、病因、诊断、防治等进行综述,为奶牛乳房炎的防治提供一定的参考依据。

鸭疫里默氏杆菌贵州分离株的耐药性及致病性分析

从贵州三穗地区某鸭场临床疑似鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)感染的病死鸭体内分离得到6株病原菌,经细菌形态观察、生化试验和PCR鉴定确定为RA。对6株RA分离株的血清型鉴定、耐药性及致病性试验,结果表明:6株分离菌中有4株为血清2型,其余2株血清型未定;所有分离株对大环内酯类和氨基糖苷类药物耐药,而对青霉素类和头孢类药物高度敏感;将血清2型RA菌株以9×107cfu/m L剂量经肌肉注射后可导致雏鸭发病死亡,病死鸭表现典型的鸭疫里默氏杆菌病临床症状。结果表明,贵州三穗地区主要流行血清2型RA,且对多种抗生素呈多重耐药且致病性强,应加强对血清2型RA的监测和防控。

贵州省鸡群中禽白血病病毒J亚群感染的调查

采用禽白血病J亚群抗体检测试剂盒对4个不同肉种鸡场的血清样本进行检测,发现ALV-J抗体阳性率平均达到16.52%(3.33%～30.0%)。对出现肿瘤病变的显性型病鸡进行病理组织学检查,在肝、肾、脾组织中观察到大量增生的、含嗜酸性颗粒的髓细胞样瘤细胞。针对J亚群gp85基因部分序列进行PCR扩增,从ALV-J抗体阳性鸡的肝病料扩增出一条545bp DNA带,而ALV-J抗体阴性鸡的样本显现阴性反应。将扩增的gp85基因序列与国内外J亚群毒株相应序列进行比较,结果核苷酸序列的同源性分别达到94.8%～96.5%和95.5%～96.8%。综合血清学、病理组织学变化和病原分子生物学鉴定结果,证实贵州省肉种鸡群中存在ALV-J亚群病毒感染。

贵州省H7亚型禽流感病毒感染的血清学和病原学分析

为了解贵州省近几年H7亚型禽流感病毒感染情况,分别采集鸡血清3 031份、卵黄962份、咽-肛拭子1 607份、环境土壤拭子394份及野鸟粪便122份样本共计6 116份,采用血凝抑制试验(HI)和实时荧光定量RT-PCR方法进行H7亚型禽流感病毒特异性抗体和核酸检测。结果显示,在鸡血清和卵黄样本中,H7亚型禽流感表达特异性抗体的阳性率分别为1.2%(37/3 031)和2.3%(22/962);在2 123份鸡咽-肛拭子、环境样本和野鸟粪便中,均未检测出H7亚型禽流感病毒核酸。这些结果表明贵州省家禽、野鸟和环境土壤中尚未发现H7亚型禽流感病毒感染。

oppCDF基因缺失对鼠伤寒沙门菌致病性的影响

[目的]沙门菌是常见的人畜共患病原菌,可引发多种食源性疾病,鼠伤寒沙门菌是沙门菌的重要血清型之一,具有重要的公共卫生研究意义。本试验旨在研究转运蛋白相关基因oppCDF对鼠伤寒沙门菌生物特性的影响,为新型沙门菌减毒疫苗的制备提供理论基础。[方法]本试验通过比较鼠伤寒沙门菌野生株及已成功构建的oppCDF基因缺失株的生化特性、遗传稳定性、耐药性、黏附性、侵袭力、半数致死量(LD_(50))及小鼠肝脏、脾脏载菌量,分析oppCDF基因与鼠伤寒沙门菌生物特性之间的关系。[结果]oppC、oppD和oppF基因分别缺失后鼠伤寒沙门菌生化特性未发生明显改变且能稳定遗传,表明oppCDF基因表型未发生变化;与野生株STM LT2相比,基因缺失株STM LT2ΔoppC对红霉素变为敏感、氯霉素敏感性降低,STM LT2ΔoppD对头孢氨苄敏感性降低,STM LT2ΔoppF对复方新诺明敏感性增强,3株基因缺失株均对氨苄西林不敏感。3株基因缺失株LD_(50)检测结果显示,与野生株STM LT2相比,STM LT2ΔoppC毒力下降,但STM LT2ΔoppD、STM LT2ΔoppF毒力分别上升1.6和8.6倍;STM LT2ΔoppC的黏附性显著降低(P<0.05),侵袭力降低,定植力极显著下降(P<0.01);STM LT2ΔoppD的黏附性、侵袭力降低,但定植力极显著上升(P<0.01);STM LT2ΔoppF的黏附性显著降低(P<0.05),但侵袭力显著增强(P<0.05),定植力极显著上升(P<0.01)。[结论]oppC基因缺失可降低鼠伤寒沙门菌的致病性,但oppD、oppF基因缺失可增强鼠伤寒沙门菌的致病性,以上结果为沙门菌的致病机制研究提供了理论基础。

贵州省规模化养猪场繁殖障碍性疾病的血清学调查

采用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)和乳胶凝集试验(LAT),对贵州省4个地区6个规模化猪场240份血清进行猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪繁殖障碍与呼吸综合征病毒(PRRSV)及猪圆环病毒2型(PCV2)抗体水平检测。结果:CS-FV、PPV和PRV免疫抗体阳性率分别为64.2%、77.9%和59.2%;PRRSV、PCV2抗体阳性率分别为10.4%和32.5%。上述结果表明,猪细小病毒病、猪伪狂犬病和猪瘟免疫效果比较理想,但6个规模场存在PRRSV和PCV2混合感染,应引起各养殖场高度重视。

sRNA RybB缺失后沙门氏菌的转录组分析

为了探明沙门氏菌在sRNA RybB缺失后的转录组变化情况,试验对沙门氏菌LT2菌株和RybB基因缺失株进行高通量测序,运用DESeq2算法筛选sRNA RybB缺失后的差异表达基因,并对其进行GO功能注释、KEGG信号通路富集分析及EggNOG功能注释,并利用实时荧光定量PCR验证筛选出的10个差异表达基因结果的可靠性。结果表明:共筛选出199个差异表达基因,其中上调基因98个,下调基因101个。差异表达基因GO功能主要注释了酰胺转运、肽转运、大分子蛋白定位等生物学过程,参与了鞭毛组装、双组分系统、沙门氏菌感染、丙酸代谢和NOD样受体信号通路等27个KEGG信号通路,EggNOG功能注释了细胞壁/膜/包膜生物发生、一般功能预测、碳水化合物运输与代谢、氨基酸的转运和代谢等蛋白分类。差异表达基因STM1049、STM1246、STM4504、STM1394、STM1050、STM3600、STM3599、STM3601、STM3598和STM3602的相对表达量与转录组测序结果的变化趋势一致。说明sRNA RybB缺失后会影响细菌的生命活动,以及可直接或间接调节沙门氏菌的各种代谢途径。

贵州省羔羊死亡原因调查分析

为明确近年来贵州省山羊养殖场羔羊死亡原因,项目组于2013年9月至2014年8月先后深入6个地(州、市)72个山羊养殖场进行实地调查,采集死亡羔羊病料样本进行病原分离鉴定和收集血清样本进行抗体检测,结果显示,调查羊场羔羊总存栏3 735只,死亡羔羊779只,死亡率20.86%,其中羔羊在冬、春、夏、秋四季的死亡率相应为14.16%、3.75%、0.91%和2.03%;引进品种山羊产羔的死亡率为31.86%,本地品种山羊为12.91%;疾病感染因素导致羔羊死亡占61.36%,母羊繁殖因素占20.80%,饲养管理因素占17.84%;从37只死亡羔羊分离鉴定出来的病原主要是大肠埃希菌、产气荚膜梭菌、肺炎链球菌和绵羊肺炎支原体,检出率分别为64.86%、29.73%、24.32%和18.92%。这些结果表明,引起贵州省羔羊死亡的原因较多,应采取综合防治措施,才能有效控制羔羊死亡的发生。

猪繁殖与呼吸综合征病毒不同基因扩增效果的比较研究

从PRRSV-ZB病毒株感染细胞培养物提取总RNA样本,以Oligo(dT)反转录后,针对PRRSVN、M和GP5基因进行PCR扩增。结果表明:N基因扩增效果明显高于GP5和M基因(p<0.05),N、M、GP5基因的最小检测量分别为0.1ug,0.1ug和0.4ug。对N、M和GP5基因的稳定性或保守性进行分析可见,M和N基因相对保守,GP5基因相对变异较大。本实验以N基因作目的基因,对11个临床发病猪场进行PRRS病原核酸检测,均扩增出377bp特异性条带。

携带pVAX1-GPV-P32重组减毒沙门菌诱导山羊免疫应答研究

为探讨携带pVAX1-GPV-P32重组减毒沙门菌诱导山羊免疫应答效果,将60只健康黑山羊随机分为3组,即重组细菌组、弱毒疫苗组和空白对照组,重组细菌组灌服重组减毒沙门菌,弱毒疫苗组股内侧皮内注射山羊痘弱毒疫苗,空白对照组不作任何处理;于不同时间段采集山羊血液、呼吸道/消化道分泌液及组织样本进行检测。结果:(1)在免疫后7、15、30和45d的山羊消化道特异性SIgA含量中,重组细菌组明显高于弱毒疫苗组(P<0.05),45d时到达最高值(18.172±0.122)μg·L-1;(2)在诱导产生特异性P32抗体上,重组细菌组略低于弱毒疫苗组,但差异不明显(P>0.05);(3)在特异性淋巴细胞转化效率上,免疫15d前重组细菌组略低于弱毒疫苗组,但免疫30d后重组细菌组高于弱毒疫苗组,但差异均不显著(P>0.05);(4)在诱导产生特异性细胞因子方面,重组细菌组山羊血清IL-2含量低于弱毒疫苗组,差异极显著(P<0.01),血清IL-5含量高于弱毒疫苗组,差异极显著(P<0.01),血清TNF-β高于弱毒疫苗组,差异显著(P<0.05),而血清IFN-γ和TNF-α含量与弱毒疫苗组差异不显著(P>0.05)。上述结果表明,构建的携带pVAX1-GPV-P32重组减毒沙门菌能诱导山羊产生较好的免疫应答反应。

三穗麻鸭Cofilin2基因序列分析及其组织表达研究

为探究三穗麻鸭丝切蛋白2(Cofilin2)基因特征及其在鸭组织中的表达规律,试验根据GenBank中鸡Cofilin2基因序列设计特异性引物,利用RT-PCR方法扩增获得目的基因,利用生物信息学软件分析三穗麻鸭Cofilin2基因特征,实时荧光定量PCR方法检测Cofilin2基因在三穗麻鸭不同组织中的表达情况。结果显示,三穗麻鸭Cofilin2基因编码区大小为498bp,可编码166个氨基酸;三穗麻鸭Cofilin2基因序列与鸡、猕猴、牛、小鼠、安大略鲑、人和猪相应序列的同源性分别为94.4%、91.6%、91.6%、87.6%、77.7%、70.5%和69.5%;系统进化树显示,Cofilin2基因在不同物种进化过程中高度保守;Cofilin2基因编码蛋白的二级结构由α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲组成,三级结构呈弯曲螺旋结构;实时荧光定量PCR检测显示,三穗麻鸭Cofilin2基因在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脑、胸腺、十二指肠、腿肌和法氏囊等组织器官中均有不同程度表达,其中心脏中表达量最高,法氏囊中表达量最低。本试验结果为三穗麻鸭抗病分子机理研究奠定了基础。