鸭瘟病毒的分子生物学研究进展

文章介绍了鸭瘟病毒的基因功能、蛋白功能、致病机制、免疫机制方面的研究进展情况,并提出相关研究存在的不足和需要加强研究的方向,为更加深入了解该病毒,从而开发新的治疗方法和策略提供参考。

禽安卡拉病生物制剂研发及药物防控的研究进展

禽安卡拉病又称禽心包积液-肝炎综合征(hydropericardium hepatitis syndrome, HHS),是由Ⅰ群血清4型禽腺病毒(Fowl adenovirus serotype 4,FAdV-4)感染引起的一种严重危害家禽养殖的传染性疾病,主要表现为心包积液、肝脏组织损伤等临床症状。该病在多个国家和地区相继暴发,给养禽业带来巨大的经济损失。目前国内尚无有效防治禽安卡拉病的商品化疫苗和特效治疗药物,因此需要进一步研究针对该病的生物性防控策略。文章综述了针对FAdV-4感染的疫苗、抗体、药物等生物性防控措施的最新研究进展,以期为禽安卡拉病的生物性防控提供参考依据。

贵州省影响猪O型口蹄疫、猪繁殖与呼吸综合征和猪瘟免疫效果的环境因素R和GAM分析

为探究贵州省影响猪O型口蹄疫、猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)和猪瘟(CSF)免疫效果的环境因素,本实验收集2015年~2018年的检测数据,采用R语言和GAM建模进行养殖地区、养殖规模、环境温度和猪场海拔高度等环境因素对猪上述3种疫病免疫效果的影响分析。单因素分析结果显示:贵州9个地区猪O型口蹄疫(FMD)抗体阳性率为65.67%~95.73%,PRRS抗体阳性率为54.36%~97.14%,CSF抗体阳性率为33.07%~93.33%,贵州各个地区猪O型FMD抗体阳性率差异显著(p<0.05),PRRS和CSF抗体阳性率差异极显著(p<0.01);规模场猪O型FMD、PRRS和CSF抗体阳性率分别为82.94%、82.85%和71.05%,散养户猪的相应疫病抗体阳性率分别为75.75%、90.12%和75.66%,规模场与散养场差异不显著(p>0.05);环境温度21℃~27℃时猪O型FMD、PRRS和CSF抗体阳性率分别为84.38%、86.24%和75.63%,10℃~20℃时猪的相应疫病抗体阳性率分别为83.81%、84.58%和70.66%,3℃~9℃时猪的相应疫病抗体阳性率分别为70.74%、83.93%和67.56%,不同环境温度的猪O型FMD抗体阳性率差异显著(p<0.05),而猪PRRS和CSF抗体阳性率差异不显著(p>0.05);海拔高度1250 m以上猪场猪O型FMD、PRRS和CSF抗体阳性率分别为80.19%、85.37%和74.54%,1100 m^1250 m猪场相应疫病抗体阳性率分别为88.60%、91.00%和78.83%,1100 m以下猪场相应疫病抗体阳性率分别为73.88%、81.73%和67.34%,不同海拔高度的猪O型FMD抗体阳性率差异显著(p<0.05),而猪PRRS和CSF抗体阳性率差异不显著(p>0.05)。多因素和GAM建模分析显示,在4种环境因素中只有环境温度对猪O型FMD抗体阳性率具有显著影响且二者呈非线性关系,其对抗体阳性率存在饱和效应,而4种环境因素对PRRS和CSF抗体阳性率均无明显影响。这些结果表明,对猪免疫O型FMD疫苗时要注意选择适宜的环境温度。本研究为贵州省猪O型FMD、PRRS和CSF疫苗合理免疫程序的制定提供一定的参考依据。

贵州省影响羊口蹄疫和小反刍免疫效果分析

为研究贵州省不同地区、养殖方式、海拔和温度对羊A、O、Asia I型FMD和PPR免疫抗体阳性率的影响。采用酶联免疫吸附实验对2015~2020年本实验室收集的贵州省9个市(州)515个养殖场的羊血清(共计8869份)进行上述疫病的免疫抗体检测,并对检测结果使用易侕统计软件和R语言进行分析。统计结果表明:羊A、O、Asia I型FMD和PPR的免疫抗体平均阳性率分别为42.57%、87.99%、73.64%和64.45%。R语言分析结果表明:羊A、O、Asia I型FMD和PPR免疫抗体阳性率在贵州省的不同地区中差异不显著(P>0.05);不同养殖方式对羊A、O、Asia I型FMD和PPR的免疫效果影响差异不显著(P>0.05);不同海拔对羊A、O、Asia I型FMD和PPR的免疫效果影响差异不显著(P>0.05);不同温度对羊A、O型FMD的免疫效果影响差异极显著(P<0.01)。结果提示,贵州省羊O、Asia I型FMD免疫抗体阳性率达到国家农业部动物疫病监测合格要求,羊A型FMD与PPR免疫抗体阳性率未达到国家农业部动物疫病监测合格要求;温度对羊A、O型FMD的免疫效果影响较大。本研究为贵州省羊A、O、Asia I型FMD疫苗合理免疫程序的制定提供一定的理论依据。

贵州省某地区养鸭场DuCV、NDV、GPV和RA共同感染的调查与分析

为了查明贵州省某地区4个规模化养鸭场6~54日龄鸭急性发病死亡的原因,试验采集A、B、C、D 4个养鸭场病死鸭的心脏、肝脏和脾脏等器官,通过病理剖检、细菌分离培养及鉴定、病毒病原核酸检测进行诊断并对检测数据整理分析。结果表明:病死鸭剖检病变主要为心包膜纤维素性渗出、肝脏肿大呈墨绿色、肝脏表面有灰白色包膜和脾脏肿大呈大理石外观等;仅分离到一种细菌,经革兰氏染色为阴性短小杆菌,细菌基因组PCR鉴定为鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipesifer,RA);病毒病原核酸检测发现鸭圆环病毒(duck Circovirus, DuCV)、鹅细小病毒(goose Parvovirus, GPV)和新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV);4个养鸭场均以病毒感染为主,感染病原样品总数由高到低分别是DuCV、NDV、GPV和RA;在检测的养鸭场中存在单独感染、二重感染、三重感染和四重感染,并以三重感染的阳性率最高,达到42.86%。说明贵州省该地区引起鸭发病、死亡的病原种类繁多且感染情况复杂,给该地区鸭病的防控工作带来了一定挑战。

动物固有免疫系统的免疫记忆研究进展

文章介绍了动物固有免疫系统的免疫记忆和形成机制研究进展情况,提出需要深入研究的方向,为明确疾病的发病机理和疫苗研发提供新的思路。

黄连防治鸭病毒性肠炎机制的网络药理学分析及动物试验验证

旨在探讨黄连防治鸭病毒性肠炎(duck viral enteritis,DVE)的作用机制,本研究首先应用中药系统药理学分析平台(Traditional Chinese Medicine System Pharmacology Analysis Platform,TCMSP)筛选黄连活性成分及作用靶点,GeneCards数据库分析DVE相关靶点,Venny和Cytoscape3.7.2软件绘制黄连与DVE交集靶点及构建“药物-成分-疾病-靶点”网络,利用STRING数据库建立蛋白相互作用网络(protein interaction network,PPI),借助DAVID数据库进行靶点GO功能富集分析和KEGG通路富集分析,然后分正常对照组、病毒感染组和黄连防治组进行动物干预试验,采集组织样本进行病理组织学观察和相关细胞因子测定,结果表明:筛选出黄连14个活性成分和212个作用靶点,其中,与DVE交集的靶点25个,涉及RNA聚合酶Ⅱ启动子转录、序列特异性DNA结合转录因子活性、免疫应答、炎症反应和细胞凋亡等生物学过程,富集在Toll样受体信号通路、炎症性肠病、细胞因子-细胞因子受体相互作用、单纯疱疹病毒感染等信号通路,核心靶点是IL-6、IL-10和STAT1;病毒感染组鸭肝、脾和十二指肠发生不同程度的病理损伤,且这些组织中IL-6含量较正常对照组鸭显著提升(P≤0.05),IL-10和STAT1含量显著降低(P≤0.05),而黄连防治组鸭肝、脾和十二指肠组织病理损伤明显减轻,IL-6、IL-10和SYAT1含量趋于正常水平。由此可见,黄连能有效缓解鸭病毒性肠炎所致的鸭机体组织病理损伤,其作用机制涉及到多种炎症反应信号通路。

饲粮中添加刺梨渣对鲤鱼肠道组织形态、抗氧化能力、免疫力及代谢组学的影响

[目的]探究饲粮中添加刺梨渣(Rosa roxburghii Tratt. residue)对鲤鱼肠道组织形态、抗氧化能力、免疫力及代谢组学的影响,以期为刺梨渣饲料在贵州山区农村稻田养鱼中的推广应用提供科学依据。[方法]选取180尾健康无病、初始体重为25 g±1 g的鲤鱼,随机分为正常组(基础饲料中不添加刺梨渣)和刺梨渣饲喂组(基础饲料中添加0.4%刺梨渣),每组设3个重复,每个重复30尾,试验期60 d。试验结束后,采集鲤鱼中段肠道,通过显微镜观察、ELISA检测和基于液相色谱的代谢组学技术分析鲤鱼肠道组织形态、抗氧化能力、免疫力及代谢组学。[结果]与正常组相比,饲喂刺梨渣对鲤鱼肠道的正常结构无不良影响,且肠道绒毛长度和肌层厚度均极显著增加(P<0.01);刺梨渣饲喂组鲤鱼肠道中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性显著升高(P<0.05),肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量显著降低(P<0.05);刺梨渣饲喂组共显著富集到2-酮丁酸、L-(+)-乳酸、丙酸、琥珀酸、D-天冬氨酸、D-谷氨酰胺、黄嘌呤核苷、次黄嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶和D-焦谷氨酸等85种差异代谢物,这些代谢物主要富集到丙酸盐代谢,丙氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸代谢,嘌呤代谢,嘧啶代谢等代谢通路。[结论]饲粮中添加刺梨渣可提高鲤鱼肠道组织抗氧化性能和免疫指标,可通过影响嘌呤和嘧啶代谢以及相关代谢物D-谷氨酰胺、黄嘌呤核苷、次黄嘌呤、胸腺嘧啶、2′-脱氧尿苷-5′-单磷酸盐和尿嘧啶等来改善鲤鱼肠道健康,进而提高机体免疫力。

BPV1贵州株L1基因序列分析及原核表达

为表达牛乳头瘤病毒1型贵州株(BPV1-GZLZ株)衣壳蛋白L1基因,采用PCR方法从贵州省六枝特区某规模化养牛场疑似病牛的皮肤肿瘤病料样品中扩增BPV1 L1基因,克隆至p MD19-T载体,测序后进行生物信息学分析;同时将BPV1-GZLZ株L1基因克隆于原核表达质粒p ColdⅠ中,经IPTG诱导L1蛋白表达,并对重组蛋白进行SDS-PAGE和Western blotting分析。生物信息学分析显示,BPV1-GZLZ株L1基因核苷酸序列长为1488 bp,编码495个氨基酸,分子结构式为C2484H3884N678O737S16,理论等电点(PI)为8.68,二级结构主要包括α-螺旋、无规则卷曲和β-折叠为主,无跨膜结构域和信号肽; BPV1-GZLZ L1基因序列与BPV1参考株的核苷酸和氨基酸同源性均为99.8%,处在同一遗传进化分支,且与BPV13和BPV2、BPV2-GZ01的亲缘关系较近; Western blotting结果显示,经IPTG诱导的重组表达蛋白能与His单抗产生特异性反应,条带为55.6 kD左右与SDS-PAGE结果一致。研究表明,试验构建了BPV1-GZLZ株L1基因原核表达载体并成功表达。

金银花对鸭瘟病毒感染鸭免疫器官功能影响的研究

鸭瘟是由鸭瘟病毒(DPV)感染导致的鸭、鹅等水禽的急性传染病。为探究中药金银花对DPV感染后鸭免疫器官(脾脏、胸腺和法氏囊)的病理损伤及其致病性的干预效果,本研究选取90只三穗麻鸭,随机均分为正常对照组(N)、病毒感染组(V)及金银花干预组(M),V组与M组鸭肌注DPV(0.2 mL/只),M组同时人工灌服金银花胶囊每日1粒(含金银花0.6±0.02 g/粒),至5 d实验结束,每天观察鸭的临床症状,并分别于感染后66h、90 h、144 h每组各剖杀10只鸭,观察各组鸭各免疫器官(脾脏、胸腺、法氏囊)的剖检病变,采集各免疫器官样品制备病理切片,观察病变;计算各组鸭各免疫器官指数;采用ELISA方法检测各组鸭各免疫器官中主要细胞因子(IL-6、IFN-γ、TNF-α)的分泌水平;利用荧光定量PCR检测各组鸭各免疫器官中DPV的载量。剖检病变及组织病变观察结果显示,与V组相比,M组鸭各免疫器官的损伤均不同程度减轻,且随感染时间的延长各器官均未出现较严重损伤,组织出血、细胞核固缩、核碎裂等病变得到缓解;免疫器官指数结果显示:与V组相比,M组鸭脾脏指数在感染后各时间点均显著升高(P<0.05),而胸腺指数在感染后各时间点均显著下降(P<0.05),法氏囊指数感染后90 h、114 h均显著升高(P<0.05)。ELISA结果显示,与V组相比,M组鸭各免疫器官中的IL-6在感染后3个时间点(脾脏)均显著上升(P<0.05)或者均极显著(胸腺)(P<0.01)或者显著(法氏囊)(P<0.05)下降;IFN-γ在感染后3个时间点均无显著变化(脾脏与胸腺)(P>0.05)或者在该3个时间点均极显著上升(法氏囊)(P<0.01);TNF-α在感染后66 h和90 h均极显著上升(脾脏)(P<0.01)或者均极显著下降(胸腺)(P<0.01),在感染后114 h极显著上升(法氏囊)(P<0.01)。荧光定量PCR结果显示,与V组相比,M组鸭各免疫器官DPV载量均有所下降。其中,脾脏中DPV载量在感染后66 h和90 h无显著变化(P>0.05),在感染后114 h显著降低(P<0.05)。胸腺中DPV载量在感染后66 h和114 h显著降低(P<0.05),在感染后90 h极显著降低(P<0.01)。法氏囊中DPV载量在3个时间点均极显著降低(P<0.01)。正常对照组鸭免疫器官无明显剖检和组织病变,且各免疫器官指数及其分泌的各细胞因子含量无显著变化,未检出DPV。上述结果表明,DPV感染可导致鸭免疫器官产生明显的病理损伤,而中药金银花则能缓解DPV所致雏鸭免疫器官的炎症反应及损伤,抑制病毒的增殖。本研究为金银花等清热解毒中药在DPV等病原感染的防制应用奠定实验基础。

NF-κB信号通路激活剂LPS/抑制剂SN50对鸭肠炎病毒增殖影响的研究

为探究NF-κB信号通路对鸭肠炎病毒(DEV)增殖的影响,本实验分别以不同终浓度的NF-κB信号通路激活剂LPS(2.0μg/mL、4.0μg/mL、6.0μg/mL)和抑制剂SN50(25.0μg/mL、50.0μg/mL、75.0μg/mL)处理鸭胚成纤维(DEF)细胞后,采用CCK8法分析LPS或SN50对DEF细胞活性影响;利用不同浓度的LPS或SN50预处理DEF细胞4 h后,再于12 h120 h后收获细胞和上清液(未感染DEV);上述经LPS或SN50预处理细胞4 h后接种DEV(MOI 0.01),12 h120 h后(每间隔12 h)分别收获细胞及上清液,采用荧光定量PCR方法分别检测上述未感染和感染DEV的DEF细胞中NF-κB1基因和DEV NP基因的转录水平;采用ELISA方法分别检测上述未感染和感染DEV的DEF细胞上清液中NF-κB信号通路关键因子(IL-1β、IL-6和MyD88)的表达水平。结果显示:不同浓度的LPS和SN50处理对DEF细胞均无明显毒性作用。荧光定量PCR结果显示,经不同浓度LPS预处理,均能有效提高DEF细胞中NF-κB1基因的转录水平,其中4.0μg/mL LPS处理的DEF细胞中NF-κB1基因转录水平最高;而在LPS预处理再感染DEV后,4.0μg/mL LPS和6.0μg/mL LPS处理的DEF细胞中NF-κB1基因转录水平整体上调(p<0.05),2.0μg/mL LPS处理的DEF细胞中NF-κB1基因的转录水平整体下调(p<0.05);不同浓度的SN50预处理后,未感染和感染DEV的DEF细胞中,均以50.0μg/mL SN50处理的细胞中NF-κB1基因的转录水平下调效果最好(p<0.05)。LPS预处理DEF细胞后感染DEV,12h84 h DEV NP基因的转录水平均受到明显抑制(p<0.01),84 h后2.0μg/mL和6.0μg/mL LPS均会促进DEV NP基因的转录水平;而经SN50预处理DEF细胞后感染DEV,细胞中DEV NP基因的转录水平均显著下降(p<0.01)。ELISA结果显示,经LPS预处理后,不感染或感染DEV,DEF细胞中IL-6表达量整体稍呈下降趋势(p>0.05),而IL-1β和MyD88的表达则呈无规律变化;经SN50预处理后不感染或感染DEV,DEF细胞中IL-1β、IL-6和MyD88的表达均无规律变化。以上研究结果表明,不同浓度LPS均可促进正常DEF细胞中NF-κB1基因的转录,而DEV则可以阻断低浓度LPS(2.0μg/mL)的这种促进作用。不感染或感染DEV,SN50均于高浓度(50μg/mL和75μg/mL)时才能有效降低NF-κB1基因的转录水平;不同浓度的LPS或SN50均对NF-κB通路关键因子的表达基本无影响;LPS在DEV感染后期才能促进其增殖,而SN50则可以有效抑制DEV的增殖。本研究为阐明NF-κB信号通路与DEV之间的相互作用关系奠定了实验基础。。

鸭肠炎病毒和A型产气荚膜梭菌共感染对鸭十二指肠代谢组学影响的研究

为探究鸭肠炎病毒(DEV)和A型产气荚膜梭菌(CpA)共感染的致病机制,本研究以DEV贵州株(DEV GZ)和CpA标准株(CVCC2030)分别及共感染37日龄健康雏鸭,采用病原分离鉴定和PCR检测确定成功感染后,采用液相色谱-质谱联用(LC-MS)技术检测DEV感染组、CpA感染组以及二者共感染组感染90 h时鸭十二指肠的代谢组学,筛选并分析潜在的差异代谢物及相关信号通路。结果显示:与对照组相比,DEV感染组感染90 h时鸭十二指肠有2’-脱氧核苷和苯丙酮酸等52种差异代谢物;CpA感染组有青霉素和3-羟基丁酸等29种差异代谢物;DEV和CpA共感染组有花生四烯酸和吲哚-3-乳酸等50种差异代谢物。DEV感染组鸭十二指肠在正负离子模式下,差异代谢物主要富集的代谢通路均为22条,且主要为氨基酸的生物合成代谢通路;CpA感染组鸭十二指肠在正离子模式下,差异代谢物主要富集的代谢通路为25条,且主要为类固醇激素的生物合成代谢通路;共感染组鸭十二指肠在正负离子模式下,差异代谢物主要富集的代谢通路分别为15条和14条,其中与免疫相关的代谢通路有色氨酸代谢和半胱氨酸-蛋氨酸代谢等。这些差异代谢物提示花生四烯酸和吲哚-3-乳酸可能成为DEV和CpA共感染鸭十二指肠的潜在生物标记物,本研究为阐明DEV与CpA共感染的致病机制提供了科学依据。

鸭疫里默氏杆菌CAMP基因的克隆、原核表达及生物信息学分析

试验旨在克隆鸭疫里默氏杆菌协同溶血素蛋白(cooperative hemolysin protein,CAMP)基因,并对其进行原核表达和生物信息学分析。以RA贵州血清2型分离株RA-SS-8基因组为模板扩增并克隆鸭疫里默氏杆菌CAMP基因,构建pET-28a-CAMP重组原核表达质粒,转化大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞,重组菌用IPTG进行诱导表达及纯化,利用SDS-PAGE和Western blotting分析表达蛋白的特征,并运用相关生物信息学分析软件对CAMP基因进行分析。结果显示,鸭疫里默氏杆菌CAMP基因大小为1026 bp,该基因序列与GenBank中公布的10株RA参考菌株(如RA-LZ01(CP045564.1))CAMP基因的相似性达99.7%。经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定后,获得大小约5369和1026 bp的基因片段,表明pET-28a-CAMP重组表达质粒构建成功。SDS-PAGE和Western blotting分析显示,表达的重组蛋白大小约为37 ku,以可溶形式进行表达,且能与His-tag单克隆抗体在37 ku处产生特异性反应,与预期结果相符。生物信息学分析表明,CAMP蛋白分子式为C_(1670)H_(2659)N_(437)O_(500)S_(12),含341个氨基酸,理论等电点(pI)为5.62,不稳定系数为40.71,表明其为不稳定的弱酸性蛋白。疏水性预测结果显示,该蛋白属于亲水性蛋白。CAMP蛋白无跨膜结构域,无信号肽,有3个O-糖基化位点,无N-糖基化位点,存在34个磷酸化位点,共有17个抗原表位。二级结构和三级结构预测结果显示,CAMP蛋白以α-螺旋和无规则卷曲为主。本试验结果为进一步研究鸭疫里默氏杆菌CAMP蛋白的功能及鸭疫里默氏杆菌病疫苗的研发提供了参考。

10种复方中草药对鲟源海豚链球菌的体外抑菌效果研究

为筛选对鲟源海豚链球菌(Streptococcus iniae)有较好抑菌作用的复方中草药。采用牛津杯对九味羌活汤、桑菊饮等10种具有抑菌效果的复方中草药进行海豚链球菌体外抑菌试验,并通过二倍稀释法测定了10种复方中草药对海豚链球菌的最小抑菌质量浓度(MIC)和最小杀菌质量浓度(MBC)。结果表明:鲟源海豚链球对九味羌活汤和桑菊饮高度敏感,抑菌圈直径分别为(24.08±3.92)、(23.92±2.34)mm,其MIC值均为62.5 mg/ml,MBC值均为125 mg/ml。鲟源海豚链球菌对养阴清肺汤、八正散、五苓散和大青龙汤4种复方中草药中度敏感,而对槐花散、藿香正气散、麻黄杏仁甘草石膏汤和痰饮丸4种复方中草药低度敏感。九味羌活汤和桑菊饮对鲟源海豚链球菌具有较好的抑菌、杀菌效果。

单宁酸对嗜水气单胞菌转录组影响的研究

嗜水气单胞菌作为水产养殖业中的主要病原菌,严重危害该产业的发展。为探究单宁酸对嗜水气单胞菌的抑菌作用及其转录组的影响,本实验将单宁酸2倍倍比稀释(8μg/mL~8 192μg/mL)后,测定单宁酸对嗜水气单胞菌ATCC 7966株的最小抑菌浓度(MIC);将嗜水气单胞菌分别与不同浓度的单宁酸共培养,根据所测细菌OD600nm值(共测24 h),绘制细菌的生长曲线。结果显示,单宁酸对嗜水气单胞菌的MIC为2 048μg/mL;浓度低于64μg/mL (临界值)单宁酸处理后不影响嗜水气单胞菌的生长。因此本实验采用64μg/mL的单宁酸与嗜水气单胞菌ATCC 7966株共培养,每组重复4次,12 h后提取各组嗜水气单胞菌总RNA,反转录为cDNA后构建cDNA文库,再利用随机引物,经PCR扩增、定量后,采用Illumina HiSeq测序平台进行转录组测序(RNA-Seq)。通过计算每个样品中r RNA的占比(rRNA%)及碱基的错误率对测序数据质控;采用Bowtie2将获得的各组嗜水气单胞菌测序数据与GenBank中嗜水气单胞菌ATCC 7966株参考基因组比对,分析它们之间的相似性。结果显示,各组测序样品的r RNA%和碱基错误率均分别低于0.8%和0.024%,且与参考基因组的相似性均大于99%,表明测序数据可靠,可以用于后续分析。采用edgeR、DESeq2和DESeq软件筛选并分析各组嗜水气单胞菌转录水平差异及显著差异的基因,采用Goatools和KOBAS软件对转录水平显著差异基因进行GO功能注释与KEGG信号通路的富集分析,利用RT-q PCR对转录水平显著上调和显著下调的各4个基因验证。结果显示:与对照组相比,单宁酸处理组嗜水气单胞菌中转录水平显著上调的基因144个,显著下调的基因104个,转录水平显著变化的基因主要集中在嗜水气单胞菌的VI型分泌系统(T6SS)、铁调控和Ton B系统、ABC转运蛋白系统相关蛋白的编码基因。GO功能注释结果显示,单宁酸处理嗜水气单胞菌后共显著富集到88个GO term,38个生物学过程(BP)、10个细胞组分(CC)、40个分子功能(MF),主要涉及蛋白质折叠、亮氨酸生物合成和代谢、铁载体生物合成和代谢、铁硫簇结合、金属簇结合、铁载体跨膜转运活性等。KEGG富集分析结果显示,单宁酸处理嗜水气单胞菌后的转录显著差异基因富集到5条信号通路,包括铁载体蛋白生物合成、硫胺素代谢、C5-支链二元酸代谢,缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成及脂质与动脉粥样硬化等。RT-q PCR验证结果显示,RNA-Seq与RT-q PCR结果基本一致。本研究首次分析了单宁酸处理嗜水气单胞菌后的转录组数据的变化,证实单宁酸主要影响嗜水气单胞菌支链氨基酸、铁载体及硫胺素的生物合成和代谢等信号通路,从而影响该菌的生理生化功能甚至毒力。本研究为全面探究单宁酸在防治嗜水气单胞菌感染中的作用及作用机制奠定了实验基础,同时也为探寻嗜水气单胞菌抗生素的替代品提供新思路。

从江香猪源干扰素α2、β在生菜中的瞬时表达及其对PRRSV复制抑制作用的研究

为在生菜中瞬时表达从江香猪源IFN-α2、IFN-α2β和IFN-β,检测其抗猪繁殖与呼吸综合征(PRRSV)的活性,本实验采用从江香猪源干扰素特异引物分别从pUCm-CJpoIFN-α2、pUCm-CJpoIFN-α2β、pUCm-CJpoIFN-β质粒中扩增IFN-α2、IFN-α2β、IFN-β基因序列,分别克隆至植物表达载体pBI121中,构建含不同干扰素的重组质粒。将各质粒分别转化根癌农杆菌LBA4404,采用真空渗透法将携带重组质粒的根癌农杆菌感染生菜,经用GUS染色和ELISA方法检测从江香猪源干扰素在生菜叶片中的表达;用qPCR方法和细胞病变抑制试验检测生菜中表达的从江香猪源干扰素蛋白抗PRRSV的活性。结果显示:本实验构建了含从江香猪源IFN-α2、IFN-α2β、IFN-β的植物表达载体PBI121-IFN-α2、PBI121-IFN-α2β、PBI121-IFN-β;GUS染色和ELISA检测结果显示从江香猪源IFN-α2、IFN-α2β、IFN-β在生菜中实现了瞬时表达;qPCR检测结果显示生菜中瞬时表达的从江香猪源干扰素蛋白在Marc145细胞中对PRRSV的复制有明显抑制作用;生菜中表达的从江香猪源IFN-α2、IFN-β、IFN-α2β分别经47、49、47稀释在Marc145细胞中仍然能够抑制100 TCID50 PRRSV的致细胞病变作用。本实验实现从江香猪源IFN-α2、IFN-α2β、IFN-β在生菜中的瞬时表达且表达蛋白具有较强抑制PRRSV的复制作用,本研究为从江香猪源干扰素抗PRRSV新复合型药物蛋白的开发利用提供参考依据。

益生菌固态发酵红薯渣条件的研究

本试验以红薯渣中添加益生菌发酵后的粗蛋白质增加率为评价指标,筛选有效提高粗蛋白质的益生菌进行复合发酵,再通过单因素与正交试验确定复合发酵最佳发酵时间、菌液接种量及发酵温度。结果表明:以产朊假丝酵母、植物乳杆菌、酿酒酵母和粪肠球菌(1:1:1:1)复合发酵,在最佳发酵条件菌液接种量7%(V/m)、温度32℃、时间3d下,发酵红薯渣中粗蛋白质含量较未发酵显著提高39.27%(P <0.05),为研发红薯渣废弃资源利用奠定理论基础。

1株鲤鱼源植物乳杆菌的分离鉴定及其生物学特性分析

【目的】筛选具有优良益生特性的鲤源乳酸菌作为水产养殖用微生态制剂候选菌株。【方法】以鲤鱼肠道内容物及黏膜为菌株的分离来源,采用MRS培养基进行菌株分离纯化,经16S rRNA测序鉴定后,对分离菌株生长特性、产酸能力、耐酸、耐胆盐、抑菌特性、药物敏感性及安全性等生物学特性进行分析。【结果】试验成功分离到1株植物乳杆菌,将其命名为YY001,该分离株在MRS培养基上菌落形态为圆形、表面光滑、边缘整齐、呈乳白色,革兰氏染色为阳性、无芽孢、两端钝圆的短小杆菌;4 h后进入对数期生长,12 h后生长达到稳定期;具有较强的产酸能力,产酸曲线显示,0~12 h pH迅速下降,培养16 h的菌液pH达3.8;在pH 3.0和0.3%胆盐的条件下具有一定耐受性;该分离株对水产常见致病菌柱状黄杆菌、维气氏单胞菌和嗜水气单胞菌均具抑菌效果,且对柱状黄杆菌的抑菌效果最显著,抑菌圈直径达34.19 mm;药物敏感性试验结果显示,分离株对卡那霉素、链霉素和万古霉素耐药;每天一次连续1周灌胃10^(8)CFU分离菌株对小鼠无毒害作用。【结论】本研究分离到的菌株YY001具有优良的生物学特性,可作为水产养殖用微生态制剂候选菌株,为后续制备鲤鱼用微生态制剂奠定基础。

嗜水气单胞菌群体感应系统及其抑制剂应用研究进展

近年来随着抗生素在水产养殖业的滥用,导致细菌耐药性的产生,因此,需要绿色、安全、高效的新型策略来缓解耐药问题。群体感应作为一种通讯机制,根据细菌细胞间的密度来调节其行为和生理反应,其中许多活性物质能通过群体感应系统在不抑制病原菌生长的情况下影响病原菌的致病性,同时减缓耐药的产生。因此,近年来抑制细菌群体感应系统的抑制剂成为研究热点。嗜水气单胞菌作为水产养殖业中的主要条件病原菌,严重危害着水产养殖业的发展。笔者介绍了嗜水气单胞菌群体感应系统的作用机制,对细菌生物被膜的调节,以及群体感应系统抑制剂中草药和益生菌在防控嗜水气单胞菌中的应用,旨在分析嗜水气单胞菌群体感应抑制在未来的发展潜力,为水产养殖业中嗜水气单胞菌的防控提供一定的参考。

猪繁殖与呼吸综合征病毒贵州株GZ-RNSP2基因的克隆与遗传变异分析

为了解猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)贵州株GZ-R的遗传变异情况及其NSP2基因的特征,本试验基于NSP2基因设计了2对特异性引物对目的基因进行巢式RT-PCR、克隆和序列分析。结果显示,第二轮巢式PCR除扩增出约3000 bp的预期条带外,还扩增出另一条约1200 bp的条带;将两DNA片段克隆至pMD19-T载体后经测序得到两条片段,大片段长2980 bp,命名为GZR-NSP2-L;小片段长1131 bp,命名为,GZR-NSP2-S;两片段同源性比对发现,GZR-NSP2-S具有GZR-NSP2-L N端第1-945位核苷酸与C端第2795-2980位核苷酸,缺失GZR-NSP2-L第946-2794位之间的核苷酸;GZR-NSP2-L与VR-2332株、Lelystad virus株的核苷酸同源性分别为81.2%、48.6%;编码氨基酸同源性比对结果与核苷酸同源性结果一致,揭示PRRSV GZ-R株属于美洲型毒株;氨基酸缺失位点比对发现,GZ-R NSP2在其第481位、第533-561位存在30个不连续氨基酸的缺失,缺失位点与PRRSV高致病性毒株一致。综上所述,可鉴定PRRSV GZ-R株为美洲型高致病性毒株。试验结果可为进一步探索PRRSV在贵州省的流行趋势以及NSP2在PRRSV复制过程中的作用机制提供一定的参考。