贵州省牛口蹄疫免疫抗体检测分析

为研究贵州省不同地区、养殖方式、海拔和温度对牛O、A及Asia 1型FMD免疫抗体阳性率的影响。采用酶联免疫吸附试验对2017-2020年收集的贵州省各市(州)282个养殖场的牛血清(共计3215份)进行上述疫病的免疫抗体检测分析。结果表明,牛O、A及Asia 1型FMD的免疫抗体阳性率分别为81.90%、67.85%和71.14%。R语言分析结果表明,牛O、A及Asia 1型FMD免疫抗体阳性率在贵州省的不同地区中差异不显著(P>0.05);不同养殖方式对牛O型FMD的免疫效果影响差异显著(P<0.05);不同海拔对牛O、A和Asia 1型FMD的免疫效果影响差异不显著(P>0.05);不同温度对Asia 1型FMD的免疫效果影响差异极显著(P<0.01)。结果提示,贵州省牛O型FMD的免疫抗体阳性率达到国家农业农村部动物疫病监测合格要求;不同养殖方式对牛O型FMD的免疫效果影响差异显著;不同温度对Asia 1型FMD的免疫效果影响差异极显著;贵州省所具有的天然海拔条件有利于牛Asia 1型FMD免疫防控。该研究为贵州省牛O、A及Asia 1型FMD疫苗合理免疫程序的制定提供一定的理论依据。

羊肺炎支原体感染对贵州不同品种羊TLRs MyD88通路因子转录水平的影响

羊肺炎支原体(Mo)可引起山羊、绵羊发生支原体肺炎。本研究旨在分析Mo感染对贵州不同品种羊Toll样受体(TLRs)MyD88通路因子基因转录水平的影响,进而分析不同品种羊对Mo感染的差异性。本研究以Mo人工感染贵州5个主要品种羊,应用TaqMan RT-qPCR方法对不同品种试验羊肺脏和血液样本TLRs MyD88通路因子基因转录水平进行定量检测与分析。结果显示,不同品种羊感染Mo后,MyD88、TRAF6、NF-κB、FOS、JUN基因mRNA相对表达量均显著上调(P<0.01)。同时发现,感染死亡的贵州黑山羊、贵州白山羊血液和肺脏样本中MyD88、FOS基因转录水平上调倍数均显著高于感染未死亡的波尔山羊、湖羊(P<0.05);感染未死亡的波尔山羊血液中NF-κB基因转录水平上调倍数均极显著高于其余四种羊(P<0.01),这种差异表达出现的原因可能是Mo对不同品种羊的致病机理不同。以上研究结果表明,贵州不同品种羊对Mo的易感程度与TLRs MyD88通路因子转录水平有关,为研究Mo对于不同品种羊的致病机制提供基础研究资料。

猪流行性腹泻病毒贵州流行株N基因的克隆、测序与生物信息学分析

为了了解贵州省猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)的流行情况,试验对猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)贵州流行株(GZ2022)N基因序列进行克隆、测序,并利用DNAStar、ProtParam、ProtScale等生物信息学分析软件对PEDV-GZ2022株N基因的同源性和遗传进化地位,以及N蛋白的分子特征和潜在功能进行分析预测。结果表明:PEDV-GZ2022株N基因大小约为1364 bp,编码441个氨基酸;PEDV-GZ2022株N基因核苷酸序列与GenBank中的PEDV参考毒株N基因的相似性为95.5%~99.8%,与PEDV经典毒株CV777 N基因核苷酸序列的相似性为95.6%,与SDLY2020毒株N基因核苷酸序列的相似性高达99.8%,PEDV-GZ2022毒株与经典毒株CV777关系相隔较远,与PEDV变异株GⅡ-b位于同一分支;PEDV-GZ2022株N蛋白中含有较多的疏水性氨基酸,为疏水性蛋白;该蛋白质存在4个N糖基化位点和37个O糖基化位点,有31个丝氨酸、14个苏氨酸及3个酪氨酸可能被磷酸化,并且抗原指数较好。说明PEDV-GZ2022株为GⅡ-b变异株,PEDV-GZ2022 N蛋白可能具有良好的抗原性,可以作为潜在的诊断抗原。

牛支原体贵州株黏附相关蛋白的初步鉴定

牛支原体(Mycoplasma bovis,M.bovis)是引起牛乳腺炎和小牛肺炎等多种牛病的重要病原体。黏附蛋白通常被认为在该生物体的致病机制中起着核心作用。因此,本研究旨在以牛支原体株贵州株(GZ-2)的4个假定蛋白为研究对象,分别命名为M27、M32、M498、M663;分别在大肠杆菌感受态细胞DE3(BL21)中进行原核表达及纯化、亚细胞定位及黏附性研究。结果显示:成功表达和纯化重组M27、M32、M498和M663蛋白;M27、M32和M498蛋白均在牛支原体总蛋白、胞膜蛋白与胞质蛋白中均出现特异印迹条带,而M663未被检测到;共聚焦激光扫描显微镜下的免疫染色结果显示,M27、M32、M498和M663蛋白和牛支原体都能黏附在胚胎牛肺细胞(EBL)上,兔抗M27、M32、M498和M663血清抗体能够抑制蛋白M27、M32、M498和M663对EBL细胞的黏附,也能抑制牛支原体对EBL细胞的黏附。流式细胞术分析结果与其一致,得到了进一步证实。综上所述,M27、M32和M498蛋白是牛支原体的黏附相关蛋白,而M663在Western blot中未被检测到,但它仍能黏附在EBL细胞上,并且其抗血清可抑制牛支原体对EBL细胞的黏附。这为诊断牛支原体相关疾病和开发预防性疫苗选择目标蛋白提供参考依据。

绵羊肺炎支原体贵州临床分离株GZ1 p109基因序列分析与原核表达

为了探究绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,Mo)贵州临床分离株GZ1 p109基因生物信息及重组蛋白p109的免疫原性,试验采用PCR扩增Mo p109部分基因并克隆至T克隆载体pMD-19T中,经DNA测序后进行生物信息学分析;将双酶切后的p109基因片段与原核表达载体pColdⅠ连接,然后转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中,用IPTG诱导重组蛋白表达,然后进行SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定。结果表明:扩增得到的Mo贵州临床分离株GZ1 p109部分基因片段大小为576 bp,编码蛋白的分子量为21.33 ku,由192个氨基酸组成;p109蛋白的二级结构主要有α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲,第1~17,24~35,52~63,72~122,138~148,150~153,161~173,182~192位的氨基酸区段抗原指数相对较高;Mo贵州临床分离株GZ1与Mo 274株(登录号为CP079199)的亲缘关系很近;试验成功构建了pColdⅠ-p109原核表达重组质粒,表达的目的蛋白大小为27 ku,该重组蛋白p109能够与抗Mo阳性血清发生特异性结合。说明试验制备的重组蛋白p109具备良好的免疫原性。

德菲尔法构建重大动物疫病预警指标体系

[目的 ]构建重大动物疫病暴发流行预警指标体系。[方法 ]以禽流感和口蹄疫为例,采用文献调研法和德菲尔专家咨询法中的专家会议法初拟重大动物疫病预警体系的框架和指标;应用德菲尔专家咨询法评价预警指标的重要性、可操作性;应用组合权重法比较各指标综合影响的大小,并将指标分类。[结果 ]筛选出禽流感和口蹄疫预警预报一级指标6项(易感动物、饲养管理和免疫情况等)以及二级指标14项(免疫效果、环境消毒、温度等),并将指标分为三类(关键指标、重要指标和一般指标)。[结论 ]初步构建了重大动物疫病暴发流行预警指标体系。

贵州省鲜猪肉中兽药残留的监测分析

为了解贵州省鲜猪肉中的兽药残留情况,采用液相色谱-质谱联用法对从贵州省9个地(州、市)24个农贸市场随机采集的108份鲜猪肉样本进行氟苯尼考胺、四环素类和磺胺类等兽药残留含量检测。结果表明:10种磺胺类、4种四环素类和氟苯尼考胺的实际检出量均在国家食品标准的最低检出限以下。结论,贵州省农贸市场销售的鲜猪肉无兽药残留,可安全食用。

基于N基因的小反刍兽疫病毒贵州流行株分子特征与分群研究

为探讨小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus,PPRV)贵州流行株N基因分子特征和分群,试验设计了1对特异性引物,应用RT-PCR技术对小反刍兽疫(peste des petits ruminants,PPR)临床样本进行N基因扩增,克隆至pMD19-T载体,对阳性重组质粒进行测序,应用DANStar软件对测序序列和参考序列进行核苷酸同源性、氨基酸同源性、变异位点及系统进化树分析。结果显示:PPRV贵州流行株N基因扩增长度为1 578bp,其相互间核苷酸、氨基酸同源性分别为99.6%~100.0%及99.2%~100.0%,与国内参考株N基因的核苷酸序列(97.7%~99.9%)及氨基酸序列(98.3%~100.0%)同源性较国外参考株(88.5%~97.7%和92.2%~98.5%)高;PPRV贵州流行株N基因编码的氨基酸同疫苗株Nigeria 75-1相比存在26个位点突变,但没有氨基酸的缺失或增加;基于N基因系统进化分析显示,PPRV贵州流行株同国内参考株处于同一个进化分支,但与国外参考株处于不同进化分支;其属于病毒进化的Ⅳ基因群,与国内参考株处于同一系统分群,但与疫苗株Nigeria 75-1(Ⅰ基因群)处于不同基因群。

2017—2018年贵州省9个规模化养猪场主要疾病免疫效果评估

为了解贵州省2017—2018年规模化养猪场主要疾病疫苗免疫情况,试验采集了9个规模化养猪场共675份血清样品,进行了血清抗体检测,并对检测数据进行抗体阳性率、平均值和变异系数分析。结果表明:9个养猪场猪瘟病毒、猪蓝耳病病毒、猪伪狂犬病gE病毒、猪伪狂犬病gB病毒、猪O型口蹄疫病毒和猪圆环病毒2型血清抗体阳性率分别为89.78%、76.44%、0.20%、95.95%、83.54%和100%,其中猪瘟病毒、猪蓝耳病病毒、猪伪狂犬病gE病毒、猪伪狂犬病gB病毒、猪O型口蹄疫病毒和猪圆环病毒免疫抗体变异系数分别为64.78%、65.33%、24.83%、85.87%、57.24%和21.71%。猪伪狂犬病病毒gB和猪圆环病毒2型的免疫抗体水平相对整齐且阳性率相对较高,其中猪场8总体免疫效果最好,猪场4猪伪狂犬病病毒gE抗体阳性率为0.20%,提示猪群可能存在猪伪狂犬病毒野毒感染,需要采取合适的防控与净化措施。

贵州省三穗县鸭疫里默氏杆菌的分离鉴定、毒力基因检测及耐药性分析

为了解贵州省三穗县鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)的流行血清型、毒力和耐药情况,本试验从贵州省三穗县6个规模养鸭场临床疑似RA感染的病鸭体内分离出6株分离菌,对病原菌进行分离鉴定、毒力基因检测和耐药性分析。细菌分离鉴定结果显示,分离菌在巧克力琼脂培养基上长出表面光滑、圆形半透明的滴状菌落;革兰氏染色呈阴性短小杆菌,瑞氏染色呈两极浓染;分离菌均不具运动性,尿素、触酶和氧化酶试验均为阳性,符合RA生化特性,将6株分离菌分别命名为SS-RA1~SS-RA6;6株分离菌的16S rRNA基因序列与NCBI上RA参考菌株的基因序列相似性≥98%,说明6株分离菌均是RA;SS-RA1~SS-RA4为血清2型且含有8种毒力基因(OmpA、CAMP、wza、AS87_04050、Fur、SIP、TbdR1和luxE基因),SS-RA5和SS-RA6为血清11型,缺失AS87_04050基因,仅含有上述其余7种毒力基因;动物回归试验结果显示,攻毒组雏鸭均全部死亡,对照组雏鸭未表现明显临床症状,表明6株分离菌对雏鸭均有致病力;药敏试验结果显示,6株分离菌仅对羧苄西林、哌拉西林、头孢他啶、头孢氨苄、头孢曲松、头孢拉定和头孢哌酮7种抗菌药物敏感,对其他13种抗菌药物均表现不同程度的耐药,对氨基糖苷类和大环内酯类抗菌药物的耐药率为100%。本试验成功分离得到6株RA,为贵州省三穗县鸭疫里默氏杆菌病的疫苗选择和药物防治提供理论依据。

2018年贵州省部分地区高致病性禽流感H5和H7亚型免疫抗体检测分析

为了评价贵州省高致病性禽流感的免疫效果,采用血凝试验和血凝抑制试验对2018年贵州省10个地区76个养殖场(33个散养户和43个规模化养殖场)送检的1304份禽血清样本进行高致病性禽流感H5和H7亚型免疫抗体检测.结果:(1)H5亚型免疫抗体总体合格率为68.10%(888/1304),其中冬春季节合格率为78.34%(358/457),夏秋季节合格率为62.57%(530/847);H7亚型免疫抗体总体合格率为65.57%(855/1304),冬春季节合格率为70.46%(322/457),夏秋季节合格率为62.93%(533/847).(2)检测的10个地区中,毕节市、安顺市、遵义市、贵阳市4个地区H5亚型免疫抗体合格;毕节市、贵阳市、安顺市、遵义市、黔西南州5个地区H7亚型免疫抗体合格.(3)检测的76个养殖场中,规模化养殖场H5亚型免疫抗体合格率为80.85%(587/726),有36个养殖场免疫抗体合格;散养户合格率为52.08%(301/578),有16个养殖户免疫抗体合格.规模化养殖场H7亚型免疫抗体合格率为83.19%(604/726),有35个养殖场免疫抗体合格;散养户合格率为43.43%(251/578),有17个养殖户免疫抗体合格.

基于TU基因的牛支原体感染病例实验室快速检测

牛支原体是一种主要引发牛呼吸系统症状为主的病原,鉴于其所致病例临床病变与我国已消灭疫病牛肺疫非常相似,该类疫病的快速鉴别诊断非常重要。实验针对贵州省疑似牛肺炎病例进行快速病原检测与目的基因序列分析,结果显示,从临床病例组织样本中扩增到大小约265 bp的TU基因目的片段,与预期结果相符;序列测定与分析显示,所扩增TU基因序列与牛支原体国内外分离株序列同源性高、亲缘关系近。实验结果表明,本次疫情为牛支原体感染所引起,为疫病防控提供了确切诊断信息。

从江县鲤爆发性死亡病例实验室诊断

2018年10月贵州省从江县某水产养殖专业合作社鲤爆发死亡,本研究对死亡病例进行了流行病学调查、病理学观察、寄生虫学检查、细菌分离鉴定和病毒PCR检测等诊断。结果显示:病鲤病变以鳃丝溃烂、体表出血、肛门红肿和眼球凹陷为主要特征,组织的主要病变是肾小球萎缩出血、肾小囊空腔、鳃丝肿胀粘连及上皮细胞脱落等;细菌分离培养可得到圆形凸起、表面光滑的灰白色菌落,经染色镜检、生理生化鉴定和16S rRNA基因测序分析,鉴定该分离菌为嗜水气单胞菌;PCR检测显示鲤浮肿病毒(Carp edema virus,CEV)为阳性,未检出鲤春病毒血症病毒(Spring viremia of carp virus,SVCV)和鲤疱疹病毒(Koi herpesvirus,KHV);显微镜观察亦未见到寄生虫虫体;分别取分离菌和鲤浮肿病毒阳性病例组织悬液进行人工感染试验,均可引起健康鲤发生死亡。上述结果表明,从江县鲤的死亡是嗜水气单胞菌和鲤浮肿病毒混合感染所致。

鸡巴氏杆菌病的实验室诊断与防治

为查明贵州省遵义市某养殖场110日龄鸡发病死亡的原因,采集病死鸡的肝脏、脾脏、肾脏、心脏、脑组织病料,通过肝脏组织触片镜检、细菌分离培养、生化试验进行细菌鉴定和药敏试验;采用PCR方法进行相关病毒核酸检测。结果:肝脏组织触片镜检观察到两极浓染的短小杆菌,细菌分离培养出革兰氏阴性短小杆菌,生化试验结果符合多杀性巴氏杆菌的特性,药敏试验显示分离菌对多西环素、四环素、新霉素、头孢拉定、诺氟沙星、庆大霉素、青霉素、丁胺卡那敏感;相关病毒PCR检测为阴性。结论:养殖场病鸡存在多杀性巴氏杆菌感染,采用敏感药物治疗后控制了病情。

一例竹鼠大肠杆菌病的实验室诊断

为查明某养殖场竹鼠发病的原因,通过剖检观察病理变化;采集病料进行细菌分离培养,分离菌通过生化试验、16S rDNA基因序列同源性分析鉴定及致病性试验进行综合诊断。结果:剖检病死竹鼠可见皮下严重出血,心脏肿大,心包有明显积液,心脏表面血管充血,肝脏淤血、肿大、边缘呈锯齿状、颜色为暗黑色,肾脏肿大伴有点状出血;从病料中分离的细菌经鉴定为大肠杆菌(命名为GZ-SS),并能致实验小鼠死亡,具有致病性。结论:综合诊断竹鼠发病死亡的原因为致病性大肠杆菌感染。

一例鸡马立克氏病与沙门氏菌病混合感染的实验室诊断

为确诊思南县某养殖专业合作社饲养的肉鸡发病死亡原因,采集病鸡羽髓、血样及病死鸡肝脏、脾脏进行细菌分离培养、相关病毒琼脂扩散试验和PCR检测。结果:肝脏组织中分离出沙门氏菌;羽髓琼脂扩散试验检测出马立克氏病抗原,血清琼脂扩散试验检测出马立克氏病抗体;肝脏、脾脏PCR检测出马立克氏病病毒核酸。结论:综合诊断为马立克氏病与沙门氏菌病混合感染。

猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、链球菌混合感染的实验室诊断

为确诊贵州省某猪场发病原因,对送检病料进行细菌分离鉴定和病毒核酸检测。结果:猪繁殖与呼吸综合征病毒实时定量荧光RT-PCR核酸检测为阳性;猪圆环病毒2型PCR扩增出大小为325 bp目的基因条带;细菌分离与生化鉴定显示存在链球菌感染,且药敏试验结果表明分离菌对硫酸安普霉素、延胡索酸泰妙菌素高度敏感。实验结果诊断为猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、链球菌混合感染。

基于Fiber1基因分型的安卡拉病毒感染病例实验室检测

为确诊贵州省某养鸡场发生疑似安卡拉病毒感染的病例,实验基于安卡拉病毒Fiber1基因设计合成引物,对病料样本进行病原核酸检测和核酸测序与序列分析。结果:(1)从病例的肝脏样本中扩增出大小约1 296 bp的Fiber1基因目的片段,与预期结果相符。(2)序列测定与分析显示,扩增的Fiber1基因序列与国内分离株序列同源性高,亲缘关系近。(3)系统进化分析显示,感染病例中的安卡拉病毒流行株(命名为:GZ-LPS)与K31、MX-SHP9、ON1和河北、江苏等地的FAdV-4分离株处于同一进化分支,而与其他血清型禽腺病毒株处于不同进化分支。结论:此次疫情经实验室诊断,确定为禽腺病毒Ⅰ群C种血清4型的安卡拉病毒感染所致。

牛支原体与附红细胞体混合感染病例的实验室诊断

为了确诊贵州省铜仁市某养牛场牛群发病的原因,采集病牛鼻拭子、耳静脉血各6份,分别进行牛支原体核酸检测、附红细胞体核酸检测和血液检查。结果:从3份鼻拭子样品中检出牛支原体核酸阳性;2份血液样品中检出牛附红细胞体核酸阳性,血液检查可见大量星芒状的红细胞。结论:牛场病例存在牛支原体与附红细胞体混合感染。

复方中药治疗鸡实验性镉中毒的效果研究

为研究复方中药治疗鸡实验性镉中毒的作用机理。试验选取90只鸡随机分为3组(空白对照组、阳性组、中药治疗组),每组30只。空白组饲喂基础日粮,阳性组饲喂基础日粮+40.31 mg/kg氯化镉,中药治疗组饲喂基础日粮+40.31 mg/kg氯化镉+4.7 g/kg复方中药,试验期为90 d。在试验第30 d、60 d、90 d,每组随机取10只鸡,测定体重,采血测血清中丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)的含量,超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、一氧化氮合酶(NOS)的活性,取心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、跖骨检测其镉含量,90 d时另取部分组织器官进行固定制作切片。阳性组鸡体重均显著低于空白对照组鸡体重(P<0.05),中药治疗组鸡体重显著高于阳性组鸡体重(P<0.05);中药治疗组能明显缓解镉引起心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、跖骨炎性细胞浸润,出血等病变;阳性组血清中SOD、GSH-Px、NOS活性NO含量显著低于空白对照组(P<0.05),MDA含量显著高于空白对照组(P<0.05);中药治疗组SOD、GSH-Px、NOS活性NO含量显著高于阳性组(P<0.05),MDA含量显著低于阳性组(P<0.05);阳性组各组织器官镉含量显著高于空白对照组(P<0.05),中药治疗组各组织器官镉含量显著低于阳性组(P<0.05)。复方中药能降低鸡组织器官镉蓄积,增强实验性镉中毒鸡的抗氧化能力,缓解镉引起鸡组织器官的损伤。