PBL教学在生物化学与分子生物学双语教学中的研究与应用

生物化学与分子生物学是一门重要的基础医学课程。为了提高教师的教学水平与学生的学习兴趣,进而从整体上提升该课程的教学质量,我们尝试将PBL教学模式应用到生物化学与分子生物学双语教学中。通过研究实践发现这种教学模式不仅提高了学生的学习积极性,还提高了学生的自主学习与独立思考能力,加深了对学习内容的理解与掌握程度。

医学生物化学课堂教学模式的改革与探讨

辩证认识传统教学模式,探索新的培养全面合格医学人才的教学模式。提出了目标教学是课堂教学的最基本模式,总结了目标教学模式的基本环节和操作策略,并阐述了如何在实施目标教学模式过程中运用以问题为基础的教学模式、案例教学模式和启发式教学。

左卡尼汀调控钙调神经磷酸酶表达抑制过氧化氢诱导心肌细胞凋亡作用

目的研究钙调神经磷酸酶(CaN)是否参与左卡尼汀对过氧化氢(H2O2)诱导心肌细胞凋亡的抑制作用。方法将新生乳鼠心肌细胞体外培养进行实验,实验分为对照组、H2O2组、左卡尼汀+H2O2组、环孢素A(CsA)+H2O2组。对照组采用生理盐水;H2O2组加入200μmol·L-1H2O2孵育12 h;左卡尼汀+H2O2组、CsA+H2O2组分别给予1.2mmol·L-1左卡尼汀1 h或1μmol·L-1CsA 30 min预处理,再分别加入H2O2继续孵育12 h。通过流式细胞仪检测细胞凋亡率,蛋白质免疫印迹法检测cleaved caspase-3、Bcl-2和Bax等凋亡相关蛋白及CaN的表达。结果与对照组相比,H2O2组心肌细胞凋亡率、促凋亡蛋白cleaved caspase-3及Bax的表达均明显增加,而其抗凋亡蛋白Bcl-2的表达明显降低,左卡尼汀及CaN特异性抑制剂CsA可明显改善上述指标。而且,左卡尼汀还可抑制H2O2刺激下CaN的过表达。结论左卡尼汀可通过调控钙调神经磷酸酶表达抑制H2O2诱导的心肌细胞凋亡。

染料木黄酮通过抑制VEGF表达抑制人口腔癌TCA8113细胞增殖

目的:观察染料木黄酮对人口腔癌TCA8113细胞增殖的影响,并探讨其作用机制。方法:MTT法、细胞计数法及集落形成实验检测细胞增殖;蛋白质免疫印迹检测血管内皮生长因子(VEGF)、细胞外信号调节激酶(ERK)及p-ERK的蛋白水平。结果:染料木黄酮能显著抑制TCA8113细胞的增殖,其抗增殖活性具有浓度依赖性;染料木黄酮还可剂量依赖性地降低VEGF、ERK及p-ERK的蛋白水平;VEGF的表达可被ERK特异性抑制剂U0126所抑制;VEGF受体拮抗剂阿西替尼及U0126均显著抑制TCA8113细胞的增殖。结论:染料木黄酮可抑制人口腔癌TCA8113细胞的增殖,其机制可能与其抑制ERK表达及活化,进而抑制VEGF的表达有关。

肌肽对低氧所致大鼠血管内皮细胞损伤的保护作用

目的:研究肌肽对低氧所致大鼠血管内皮细胞损伤的影响。方法:建立低氧条件下大鼠血管内皮细胞损伤模型,用MTT法观察肌肽对低氧损伤的血管内皮细胞活性的影响,测定细胞培养基中LDH活力,并对细胞骨架进行考马斯亮蓝R-250染色观测其细胞结构。结果:浓度为10mmol/L～20mmol/L肌肽孵育血管内皮细胞6h后,可以抑制缺氧12h和24h引起的血管内皮细胞活性下降,同时减少LDH的释放,保持细胞骨架完整。结论:肌肽对低氧所致的血管内皮细胞损伤具有保护作用。

黄芪多糖对异丙肾上腺素诱发的SERCA2a表达及活性降低的影响

目的探讨黄芪多糖对异丙肾上腺素(isopreterenol,ISO)刺激下心肌细胞SERCA2a表达的影响。方法采用Real-time PCR法检测SERCA2a mRNA的表达;利用蛋白质免疫印迹法检测SERCA2a蛋白的表达。以4-硝基酚磷酸二钠(p-NPP)法检测SERCA2a的活性。结果与对照组相比,ISO组心肌细胞SERCA2a mRNA及蛋白的表达均明显降低,而黄芪多糖剂量依赖性地逆转上述降低。此外,黄芪多糖还可明显提高SERCA2a的活性。结论黄芪多糖可缓解ISO引起的SERCA2a表达及活性的下调。该作用可能是黄芪多糖缓解心肌细胞内Ca2+超载,进而发挥其心血管保护作用的重要机制。

蛋白激酶Wee1B在小鼠1-细胞期受精卵中的表达及其定位

目的:检测小鼠1-细胞期受精卵各个细胞周期中蛋白激酶Wee1B的表达水平及其定位水平,初步阐明Wee1B对哺乳动物受精卵早期发育调控的机制。方法:超排卵获得小鼠1-细胞期受精卵,收集卵细胞后用RT-PCR和Western blotting方法检测Wee1B的mRNA和蛋白表达水平;放射自显影测定Wee1B活性;间接免疫荧光观察Wee1B在各个细胞时期的定位。结果:小鼠1-细胞期受精卵G1、S、G2和M期Wee1BmRNA相对表达量比较差异均无统计学意义(P>0.05);S、G2和M期Wee1B蛋白表达量与G1期比较差异有统计学意义(P<0.01);与G1期比较,S、G2期Wee1B活性逐渐增高(P>0.05,P<0.01),M期Wee1B活性迅速下降(P<0.01)。G1期和S期细胞Wee1B蛋白偶联的红色荧光信号主要集中分布于细胞核,但在G2期细胞红色荧光信号弥散分布于细胞浆,在M末期和2-细胞期可见红色荧光信号又重新分布于细胞核,细胞浆内荧光减弱。结论:蛋白激酶Wee1B在小鼠1-细胞期受精卵各个细胞周期动态表达,Wee1B蛋白存在核浆转位,Wee1B的定位变化可能调控小鼠受精卵有丝分裂。

左卡尼汀通过抑制钙/钙调素依赖蛋白激酶Ⅱ信号通路抑制过氧化氢诱导的大鼠心肌细胞凋亡

目的:观察左卡尼汀对过氧化氢(H2O2)诱导的大鼠心肌细胞凋亡的保护作用及其机制。方法:利用200μmol/L H2O2刺激12 h,建立体外原代培养新生乳鼠心肌细胞凋亡模型。Ca2+螯合剂1,2-双(2-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N',N'-四乙酸(BAPTA)、钙调素依赖蛋白激酶II(CaMKII)特异性抑制剂KN93及左卡尼汀分别于加入H2O2前30 min或1 h加入,以检测这3种药物对H2O2刺激下心肌细胞活力、细胞凋亡、细胞内静息钙浓度([Ca2+]i)及磷酸化CaMKII(p-CaMKII)表达的影响。利用MTT比色法检测心肌细胞活力;流式细胞仪检测细胞凋亡率;利用激光共聚焦扫描检测[Ca2+]i;蛋白质免疫印迹法检测cleaved caspase-3及p-CaMKII的表达。结果:模型组经200μmol/L H2O2作用12 h后,细胞活力显著下降,细胞凋亡率显著增加。BAPTA、KN93及左卡尼汀预处理显著抑制上述细胞损伤。进一步研究发现,H2O2诱导的[Ca2+]i水平升高、cleaved caspase-3及p-CaMKII的表达增加均可被上述3种药物不同程度地抑制。结论:左卡尼汀可抑制H2O2所致的心肌细胞凋亡,该心肌保护作用可能与其抑制Ca2+/CaMKⅡ信号通路有关。

蛋白激酶CK2抑制剂TBB对甲状腺鳞癌细胞株SW579 CK2β和Akt表达的影响

目的:观察四溴苯三唑(TBB)对甲状腺鳞癌SW579细胞株CK2β和Akt表达的影响,探讨TBB抗甲状腺癌的作用机制。方法:体外培养SW579细胞,实验分为对照组(未加任何处理组和DMSO组)、TBB组(终浓度为25μmol·L-1)和Wortmannin组(终浓度为100 nmol·L-1)。MTT比色法测定细胞生长抑制率,同时测定蛋白激酶CK2的活性。采用RT-PCR方法检测SW579细胞CK2β及Akt的mRNA表达,分析各处理组CK2β及Akt基因表达变化。采用Western blotting方法检测SW579细胞CK2β及Akt的蛋白表达,分析各处理组CK2β及Akt的蛋白表达变化。结果:与对照组比较,TBB组SW579细胞生长抑制率明显增加(P<0.01),细胞内CK2的活性明显降低(P<0.01)。RT-PCR结果表明,与对照组比较,TBB组CK2β的mRNA表达水平显著降低(P<0.01),Akt的mRNA表达水平无明显变化(P>0.05)。Western blotting结果表明,与未处理组比较,Wortmannin组内源性CK2的活性无明显变化(P>0.05),TBB组CK2β的表达明显降低(P<0.01),同时Akt Thr308和Ser473磷酸化状态受到抑制(P<0.01),总Akt水平无明显变化。结论:TBB可降低SW579细胞蛋白激酶CK2β的表达,进而再下调Akt的活性。

五味子多糖对甲状腺癌细胞株SW579凋亡及survivin表达的影响

目的:探讨五味子多糖对人甲状腺癌SW579细胞株的生长抑制作用及其机制。方法:48只成年雄性Wistar大鼠分为阴性对照组和药物组,阴性对照组予以生理盐水,药物治疗组予以不同剂量的五味子多糖,分别提取其血清。SW579细胞分为空白组、阴性对照组和药物组。空白组为15%小牛血清的RPMI-1640培养液,阴性对照组细胞加入阴性组大鼠的纯化血清,药物组分别加入不同浓度(100、200和400mg·kg-1)的含药血清,AO/EB荧光染色和流式细胞仪检测细胞凋亡情况,MTT法检测细胞增殖情况,Western blotting检测细胞survivin的表达。结果:流式细胞术结果显示,低、中和高剂量药物组细胞凋亡率为8.63%、35.63%和38.32%,明显高于空白对照组和阴性对照组细胞凋亡率(4.23%和4.10%)(P<0.01),并随剂量增加而增加。阴性对照组细胞生长抑制率为(0.12±0.06)%,低、中和高剂量药物组细胞生长抑制率为(27.51±1.62)%、(34.69±0.79)%和(45.83±1.33)%,药物组与阴性对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)。Western blotting检测低、中、高剂量药物组细胞survivin的表达明显低于空白对照组和阴性对照组(P<0.01)。结论:五味子多糖能有效抑制人甲状腺癌细胞株SW579中survivin基因表达,诱导SW579细胞凋亡,抑制肿瘤细胞增殖。

肌肽对ECV304细胞缺氧损伤的保护作用

目的研究肌肽对缺氧所致人体内皮细胞系ECV304细胞损伤的影响。方法建立缺氧条件下ECV304细胞损伤模型,用MTT法观察肌肽对缺氧损伤的ECV304细胞活性的影响,测定细胞培养基中乳酸脱氨酶(LDH)活力,并对细胞骨架进行考马斯亮蓝R-250染色观测其细胞结构。结果浓度为10～20 mmol/L肌肽孵育ECV304细胞6 h后,可以抑制缺氧12 h和24 h引起的ECV304细胞活性下降,同时减少LDH的释放,保持细胞骨架完整。结论肌肽对缺氧所致的ECV304细胞伤具有保护作用。

四溴苯三唑对甲状腺鳞癌SW579细胞凋亡的影响

目的观察四溴苯三唑(TBB)对甲状腺鳞癌SW579细胞株生长增殖和凋亡的影响。方法将甲状腺鳞癌细胞株SW579分为对照组和实验组。实验组细胞均在培养24 h后加药,加入不同浓度的TBB,使其终浓度分别为12.5、25、50、75、100μmol/L。培养到一定时间后,在倒置显微镜下观察细胞生长情况及形态变化;四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测培养细胞的增殖情况;流式细胞术检测细胞凋亡率;RT-PCR方法检测细胞凋亡相关基因Caspase-3 mRNA表达。结果低浓度TBB组(12.5、25、50μmol/L)肿瘤细胞有向良性细胞形态转化的趋势;高浓度组(75、100μmol/L)细胞生长密度较对照组明显降低,与低浓度组相比,向成熟分化的趋势不明显。MTT结果显示,实验组细胞均出现显著的生长抑制作用,且呈剂量依赖性。实验组随着TBB药物浓度的升高,S期细胞在细胞周期中所占比例逐渐减少,G1期细胞则明显增加,细胞滞留在G1期。RT-PCR方法检测发现实验组细胞凋亡相关基因Caspase-3 mRNA表达水平上调。结论 TBB可抑制甲状腺鳞癌SW579细胞增殖,促进细胞凋亡,且呈剂量依赖性;其机制可能与上调Caspase-3基因表达,激活Caspase途径有关。

五味子多糖对CCl_4诱导的肝损伤大鼠亚细胞水平的保护作用

目的研究五味子多糖对CCl4引起肝损伤大鼠超微结构的保护作用。方法 Wistar大鼠被随机分为对照组、CCl4损伤组、不同浓度的五味子多糖处理组,分别予以生理盐水、10%CCl4和不同浓度的五味子多糖提取液(100、200和400 mg/kg)。检测血清ALT、AST活性;肝匀浆MDA、SOD、ATPase和γ-谷氨酰基转肽酶(γ-GT)酶活性及含量变化;透射电镜下观察肝脏超微结构的改变。结果大鼠摄入五味子多糖后的低、中、高剂量组与CCl4诱导的肝损伤大鼠血清ALT、AST活性比较显著降低(P<0.01),肝中MDA的生成量显著减少〔对照组(0.91±0.27),模型组(3.69±0.34),低剂量组(1.30±0.26),中剂量组(0.99±0.13),高剂量组(0.96±0.43),P<0.01〕,SOD、ATPase和γ-GT酶活性均明显增强(P<0.01),并呈现剂量依赖效应。经治疗后肝脏组织的总抗氧化能力显著提高,电镜下可见CCl4引起的肝脏组织气球样变、脂肪变性、炎症浸润及线粒体肿胀的超微结构均得到明显改善。结论五味子多糖提取物对肝细胞具有明显的保护作用,这种作用可能与其拮抗CCl4毒性代谢产物导致的脂质过氧化对肝亚细胞结构的损伤有关。

下调蛋白激酶Wee1B表达对小鼠1-细胞期受精卵有丝分裂的促进作用

目的:利用特异性发夹结构Wee1BshRNA,探讨蛋白激酶Wee1B对小鼠受精卵早期发育的影响。方法:超排卵方法获得小鼠1-细胞期受精卵并显微注射质粒,实验分为未注射组、TE缓冲液注射组、Control shRNA注射组和Wee1BshRNA注射组,收集各组卵细胞后用RT-PCR和Western blotting方法检测Wee1B shRNA的干涉效能;荧光显微镜观察受精卵的形态变化、计数卵裂率;放射自显影测定Wee1B活性。结果:与TE缓冲液和Control shRNA注射组比较,Wee1BshRNA注射组小鼠1-细胞期受精卵Wee1BmRNA水平和蛋白表达显著降低;与其他3组比较,Wee1BshRNA注射组Wee1B的激酶活性明显降低;未注射组、TE缓冲液注射组和Control shRNA注射组在hCG注射33h后1-细胞期受精卵的卵裂率分别为71.91%±1.74%、72.90%±2.25%和72.28%±2.06%,3组间比较差异无统计学意义(P>0.05);而Wee1BshRNA注射组的卵裂率提高18.00%,为90.00%±0.77%,与其他3组比较差异均有统计学意义(P<0.01)。结论:Wee1B表达沉默可提高小鼠1-细胞期受精卵的卵裂率,说明Wee1B负调控小鼠受精卵有丝分裂的进程。

dbcAMP通过Cdc25B蛋白调控小鼠1-细胞期受精卵发育

为了研究PKA激活剂dbcAMP通过调控小鼠Cdc25B蛋白S149和S321位点磷酸化状态影响小鼠1-细胞期受精卵的发育,将质粒pBSK-Cdc25B-WT、pBSK-Cdc25B-S149A、pBSK-Cdc25B-S321A和pBSK-Cdc25B-S149A/S321A体外转录成mRNA;显微注射入S期受精卵中,在2 mmol/LdbcAMP的M16培养基中培养,观察其对受精卵发育、MPF活性及CDC2-pTyr15磷酸化状态的影响.结果显示,在有dbcAMP存在时,各组受精卵卵裂时间延迟,但Cdc25B-S/A-mRNAs注射组受精卵卵裂率明显高于Cdc25B-WT-mRNA注射组,MPF活性提前达到高峰;CDC2-pTyr15磷酸化状态和MPF活性变化相一致.因此,在小鼠1-细胞期受精卵有丝分裂过程中,PKA对小鼠Cdc25B蛋白S149位点与S321位点的磷酸化修饰是控制受精卵G2/M转换的重要方式.

左卡尼汀抑制过氧化氢介导的NFATc3核转位

目的:探讨在过氧化氢(H2O2)刺激下,左卡尼汀对心肌细胞内胞浆活化T细胞核因子3(NFATc3)的表达及分布的影响。方法:以200μmol/L H2O2刺激心肌细胞12 h建立氧化应激模型。在药物处理组,于氧化刺激前30 min加入左卡尼汀及钙调神经磷酸酶(CaN)特异性抑制剂环孢素A(CsA)。待刺激完成后,利用蛋白质免疫印迹法检测细胞内总NFATc3,以及胞浆内和胞核内NFATc3的水平,并以免疫荧光法检测NFATc3在细胞中的分布状况。结果:H2O2刺激不影响心肌细胞NFATc3的表达,但可诱导其由胞浆至胞核的转位。左卡尼汀预处理可以显著抑制NFATc3的核转位。结论:左卡尼汀可通过抑制NFATc3的核转位发挥其抗氧化应激损伤的作用。

Wee1B蛋白S15位点突变抑制小鼠1-细胞期受精卵的发育

为研究小鼠Wee1B蛋白S15位点磷酸化状态对小鼠1-细胞期受精卵发育的影响,构建pcDNA3.1/V5-His-TOPO-Wee1B-S15A(Ser突变成Ala)/D(Ser突变成Asp)突变体,体外转录成mRNAs.对小鼠进行超排卵后当晚与雄鼠1∶1合笼,第2 d早取受精卵后培养至S期,显微注射Wee1B-WT(野生型)/KD(激酶失活型)-mRNAs和突变体Wee1B-S15A/D-mRNAs,观察其对受精卵发育、有丝分裂促进因子(MPF)活性及CDC2-pTyr15磷酸化状态的影响.结果表明,过表达Wee1B-WT和Wee1B-S15A/D可有效抑制受精卵有丝分裂进程,明显降低卵裂率.过表达模拟磷酸化的突变明显抑制MPF的活性,CDC2-pTyr15磷酸化状态和MPF活性变化相一致.因此,在小鼠1-细胞期受精卵有丝分裂过程中,PKA对小鼠Wee1B蛋白S15位点的磷酸化修饰是控制受精卵G2/M转换的重要方式.

CDC25B蛋白亚细胞定位调控小鼠1-细胞期受精卵发育

为探讨小鼠细胞分裂周期25B(CDC25B)蛋白149位丝氨酸磷酸化状态对小鼠1-细胞期受精卵中CDC25B的亚细胞定位和发育的影响,应用定制的CDC25B-pS149位的磷酸化和非磷酸化抗体检测小鼠1-细胞期受精卵各细胞时期的磷酸化和非磷酸化状态;应用免疫荧光观察各期受精卵中CDC25B蛋白的定位情况;将质粒pEGFP-CDC25B-WT、pEGFP-CDC25B-S149A和pEGFP-CDC25B-S149D融合质粒及空载体质粒显微注射入G1期受精卵中,观察不同显微注射组小鼠1-细胞期受精卵中外源性CDC25B蛋白亚细胞定位.结果显示,CDC25B-S149位丝氨酸在G1和S期被磷酸化,在G2和M期去磷酸化.1-细胞期受精卵从G2向M期的转换过程中,发生了CDC25B向细胞核区的移位,到2-细胞初期,部分CDC25B蛋白又从细胞核回到细胞浆.实验结果提示,小鼠1-细胞期受精卵G2/M期转换过程中,CDC25B的S149位点磷酸化修饰可能是对CDC25B细胞内定位及其活性的精确调节方式.

BAG3蛋白Ser187位点磷酸化诱导人甲状腺癌FRO细胞上皮间质转化

Bcl-2相关抗凋亡蛋白3(Bcl-2 associated athanogene 3,BAG3)是BAG家族的重要成员,调节肿瘤细胞的粘附、迁移和侵袭,促进恶性肿瘤的复发和转移.本室前期工作证明,PKCδ可催化BAG3的Ser187位点磷酸化.本文研究BAG3蛋白磷酸化修饰对甲状腺癌FRO细胞EMT表型转化的影响.稳定转染野生型WT-BAG3、模拟磷酸化型S187D-BAG3、阻碍磷酸化型S187A-BAG3 FRO细胞后,观察细胞形态的变化.结果显示,稳定转染模拟磷酸化型S187D-BAG3引起甲状腺癌FRO细胞呈现明显的间质细胞形态.实时PCR和Western印迹,结果显示,稳定表达S187D-BAG3显著上调间质细胞标记物N-cadherin和波形蛋白mRNA与蛋白质在FRO细胞的表达,但下调上皮细胞标记物E-cadherin的mRNA和蛋白质的表达.同时,免疫荧光结果显示,稳定过表达S187D-BAG3的FRO细胞,E-cadherin和β-catenin出现向核周的内化.本文结果提示,BAG3蛋白磷酸化修饰可诱导甲状腺癌FRO细胞上皮间质转化.

蛋白激酶CK2β小干扰RNA促进小鼠受精卵早期发育

目的:利用特异性小发夹RNA(siRNA)寡核苷酸片段,研究蛋白激酶CK2调节亚基CK2β对小鼠受精卵早期发育的影响,阐明调控小鼠受精卵早期发育的机制。方法:超排卵获得小鼠1-细胞期受精卵,分别显微注射TE缓冲液、scramble siRNA和CK2βsiRNA,收集卵细胞后用RT-PCR和Western blotting方法检测CK2βsiRNA的干涉效能;相差显微镜观察受精卵的形态变化、计数卵裂率;放射自显影测定M期促进因子(MPF)活性。结果:与TE缓冲液和scramble siRNA组比较,CK2βsiRNA组CK2β的mRNA水平和蛋白表达显著降低(P<0.01),MPF的活性明显升高(P<0.01),在人绒毛膜促性腺激素(hCG)注射后28.5h达到高峰;受精卵第一次有丝分裂加速,CK2βsiRNA组在hCG注射后28.5h大多数受精卵已经分裂为2-细胞期胚胎;hCG注射后32.0h卵裂率为89.5%,与TE缓冲液和scramble siRNA组比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论:CK2βsiRNA通过提前激活MPF活性,进而促进小鼠1-细胞期受精卵的发育。