苹果金属硫蛋白基因MdFjMT2克隆及生物信息学分析

以红富士苹果(Malus domesticaCV Red Fuji)浓红型芽变和其条红母株为试材,构建抑制性差减杂交(Suppression Subtractive Hybridization,SSH)文库,差异筛选SSH-cDNA文库,经过大量测序构建成红富士苹果EST序列本地数据库,对本地数据库进行Blastn检索,得到42条金属硫蛋白基因MdFjMT2的cDNA片段,通过序列拼接和逆转录PCR(RT-PCR)方法,获得了红富士苹果金属硫蛋白基因MdFjMT2全长cDNA序列(Gen-bank登录号为HQ730757),该基因全长684bp,其中5′非翻译区97bp,3′非翻译区347bp,编码区(Coding sequence,CDS)为240bp,编码79个氨基酸,推测蛋白分子量为7.7938kDa,理论等电点为4.75。该基因具有金属硫蛋白基因的典型结构域特征,编码的氨基酸序列中含有14个半胱氨酸残基Cys(C),Cys残基的排列特征是以CC、CXC和CXXC集中分布在肽链的N端和C端。系统进化分析表明MdFjMT2与砂梨(Pyrus pyrifo-lia)、苹果(Malus domestica)和小金海棠(M.xiaojinensis)等植物金属硫蛋白具有较近的亲缘关系,与扁桃(Prunus dulcis)、旱柳(Salixmatsudana)、美味猕猴桃(Actinidia deliciosa)等植物的亲缘关系较远。生物信息学分析结果表明,MdFjMT2主要位于叶绿体中,没有信号肽,是非跨膜亲水性蛋白,其蛋白质二级结构的主要元件是无规则卷曲,没有功能结构域。这些结果为Md-FjMT2的结构与功能挖掘提供一定的参考。本研究结果有助于研究该基因在苹果着色中的作用,阐明苹果着色的分子机制。

拮抗菌株混合发酵液对烟草黑胫病和青枯病的防治作用

黑胫病和青枯病是危害烟草生长的主要土传病害,解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株F012和F028对烟草黑胫病和青枯病等多种植物致病菌具有较强拮抗作用。用平板对峙法和盆栽试验研究F012和F028混合发酵液对烟草黑胫病和青枯病的防治作用及机制。结果表明:平板对峙试验中混合发酵液对烟草黑胫病病原菌抑菌率为77.91%,对烟草青枯病病原菌的抑菌圈直径为31.7 mm;盆栽试验中对烟草黑胫病和青枯病防效分别为74.49%和77.27%;混合发酵液能显著上调烟草叶片抗病关键基因NtPAL、NtEDS1、NtPR1和NtPR2的表达,提高苯丙氨酸解氨酶、几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶和多酚氧化酶等保护酶活性。由以上结果可知,F012和F028混合发酵液可以激活烟草防御系统,提高烟草对黑胫病和青枯病的抵抗能力。F012和F028菌株将是研制复合微生物菌剂的理想原料。

葡萄VvWRKY71转录因子的生物信息学分析

WRKY转录因子在植物中广泛存在,参与了生长发育和逆境等多种生物学过程。利用生物信息学方法对葡萄VvWRKY71转录因子的理化性质、二级结构、保守结构域、亚细胞定位、功能和系统进化等方面进行了预测和分析。结果表明:该蛋白由311个氨基酸组成,分子量为34.8 kDa,属于亲水性不稳定蛋白;蛋白质二级结构主要由无规则卷曲和α-螺旋组成;其C端具有高度保守的WRKY结构域,亚细胞定位结果表明该蛋白位于细胞核,功能预测结果显示其主要参与了转录和转录调控过程。由以上结果提示,VvWRKY71作为转录因子参与了多种生物学过程。

基因工程实验教学的改进与问题剖析

本文对基因工程实验教学中所进行的改革进行了总结,分析了师资队伍、实验教学内容和考核方式等因素对学生科研能力和兴趣培养的影响,对本课程教学中依然存在的问题也进行了剖析。

黄河三角洲盐碱地大棚葡萄栽培技术规程

黄河三角洲位于山东省东北部,是世界上暖温带最年轻的湿地生态系统。由于成陆前受海水长期浸渍,地下水位较高,且有较高的矿化度,土壤年蒸发量大,因而形成了大面积的盐碱地。土壤盐渍化严重阻碍当地传统农业经济的发展,为加强盐碱地综合利用和探索适于盐碱地的果树栽培模式,本文结合国家行业标准及盐碱地葡萄栽培技术特点,从园地选择、大棚设计、苗木栽植、土壤改良、花果管理、温湿度调控及病虫害防治等设施葡萄栽培一系列关键技术出发,提出了黄河三角洲大棚葡萄标准化栽培技术规程,旨在为当地葡萄产业升级和可持续健康发展提供理论参考。

叶面喷施外源氨基酸对茶叶产量和品质的影响

本试验以秋季生长的鸠坑茶为材料,采用60μmol/L谷氨酸、40μmol/L天冬氨酸及两种氨基酸混合进行叶面喷施处理,测定茶树叶片叶绿素与氮含量、百芽重和产量及茶叶茶多酚、茶氨酸和咖啡碱含量等指标,研究喷施氨基酸不同处理对茶叶产量和品质的影响。结果表明,与喷清水对照相比,喷施谷氨酸、天冬氨酸及两种氨基酸混合处理均能显著增加茶树叶片叶绿素和氮含量及百芽重和产量,谷氨酸和天冬氨酸混合喷施效果更好,产量较对照提高17.28%;喷施天冬氨酸茶树叶片茶多酚含量显著提高17.06%,喷施谷氨酸茶树叶片茶氨酸含量显著提高27.84%,而谷氨酸和天冬氨酸混合喷施茶树叶片茶多酚、茶氨酸和咖啡碱含量分别显著提高34.33%、46.69%和17.81%。综上,外源喷施氨基酸叶面肥可显著改善茶叶保健功效和品质,且以两种氨基酸混合液喷施效果最好。

北沙参补骨脂素合成酶基因 GlPS1 原核表达载体的构建和蛋白诱导表达

北沙参(Glehniae Radix)为伞形科植物珊瑚菜(Glehnia littoralis)的干燥根,具有良好的药用价值和较高的经济价值。补骨脂素(psoralen)是北沙参香豆素类化合物主要的活性成分之一,对白血病细胞有较强的杀伤作用,对支气管平滑肌有舒张作用。补骨脂素合成酶(GlPS)是北沙参补骨脂素生物合成途径的最后一步关键酶。本试验通过PCR扩增获得对北沙参补骨脂素合成酶基因GlPS1,通过酶切、连接、转化、平板培养和提取质粒构建原核表达载体;将构建好的表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中,实现GlPS1基因的IPTG诱导原核表达。该研究表明被诱导表达的GlPS1蛋白存在于菌体沉淀中,不溶于上清液。研究结果为验证GlPS1基因的功能及使用基因工程方法调控GlPS1蛋白表达奠了基础。

农杆菌介导的花生遗传转化体系的优化

以花生胚小叶及其诱导形成的愈伤组织为转化受体,采用农杆菌介导法,通过评估外植体GUS基因瞬时表达率,优化花生遗传转化条件。结果表明,侵染液中添加表面活性剂2-氮吗啉乙烷磺酸(MES)150mg/L或烟草提取物0.5ml/30ml有利于提高胚小叶外植体GUS瞬时表达率;采用针刺法辅助农杆菌介导转化,其胚小叶外植体多点GUS瞬时表达率(29.1%)明显高于未针刺的对照(12.1%);利用愈伤组织作为转化受体,其多点GUS瞬时表达率高达70.1%。利用此优化体系进行花生遗传转化,获得的抗性苗2011年经嫁接、移栽于试验田,PCR检测获得了T0代转基因植株,2012年部分T1代植株也检测出目的条带。

利用回交法快速选育高油酸花生新品系

以普通花生品种花育22为母本、高油酸花生品种开农176为父本杂交得到F1杂种,筛选油酸含量高于60%且同时含有FAD2a和FAD2b位点的F1为杂交父本,以花育22为轮回亲本(母本)连续回交得到BC1F1~BC4F1代回交种。利用近红外光谱仪测定F1及BC1F1~BC4F1籽粒的油酸、亚油酸含量,选择油酸含量大于60%的种子,用刀片切取种子小部分子叶提取DNA,以F0.7/R3为引物进行PCR扩增及测序,根据测序峰图差异表现筛选出同时含有FAD2a和FAD2b位点的种子作为下一代回交的父本。切去部分子叶的种子切口用石蜡封闭,播种前浸泡于40℃温水中催芽,对12 h后未露白的种子用100 mg L–1乙烯利浸泡4 h后再转入40℃温水浸泡至24 h,发芽率可达到98%。2013年春季开始杂交,2016年春在青岛播种BC4F2代种子,取幼苗期幼叶鉴定基因型,筛选出基因型为aabb的单株,收获时选留农艺性状类似于花育22的优良单株,再利用近红外光谱仪测定所选单株油酸含量,获得油酸含量在70%以上、油酸亚油酸比值大于7.0的单株24个。这些单株与花育22相比,农艺性状基本相同,称为改良花育22高油酸花生新品系。

花生β-1,3-葡聚糖酶基因启动子的克隆及功能分析

植物β-1,3-葡聚糖酶属于一种重要的植物病程相关蛋白(PR蛋白),容易受到激发子的诱导而积累。用1.5 mmol/L水杨酸(SA)对花生品种花育20号幼苗进行诱导处理0.5、12、24、36、48和72 h后,提取RNA进行荧光定量检测β-1,3-葡聚糖酶基因(Ah-Glu)的表达量。结果表明,经诱导24 h后β-1,3-葡聚糖酶基因的表达量达到最高,是未经SA诱导的1.8倍。根据前期已克隆的花生β-1,3-葡聚糖酶基因序列(GenBank JQ801335),在其5'端设计3个嵌套的特异性引物扩增其上游启动子序列。以花育20号基因组DNA为模板,利用TAIL-PCR方法,扩增得到973 bp的花生β-1,3-葡聚糖酶基因启动子片段,在NCBI网站注册序列号为GenBank KC290400,并命名为Ah-Glu-Pro。PLACE和PlantCARE在线预测分析表明,Ah-Glu-Pro序列中含有TATA-box和CAAT-box等核心元件,还含有病原菌及水杨酸响应的顺式调控元件。根据Ah-Glu-Pro序列设计上下游引物,采用普通PCR法从花育20号扩增得到931 bp的启动子序列,命名为Ah-Glu-P。将Ah-Glu-P取代pCAMBIA1301质粒中的CaMV35S启动子,构建植物表达载体pCAMBIA1301-Ah-Glu-P。通过农杆菌介导法将pCAMBIA1301-Ah-Glu-P转化洋葱表皮细胞,经5 mmol/L SA诱导处理48 h后进行GUS染色。结果表明:经SA诱导后的洋葱表皮细胞GUS组织化学染色显示为蓝色,未经SA诱导的洋葱表皮细胞GUS组织化学染色未显示蓝色,说明Ah-Glu-P是一个可被诱导的启动子,可能含有对SA响应的顺式调控元件。

快中子辐照对花生种子胚小叶植株再生的影响

以花生品种花育22号的成熟饱满种子为试材,采用14MeV不同剂量的快中子(0、9.7、14和18Gy)进行辐照处理。处理后的种子经表面杀菌后,取胚小叶作为外植体先后在添加2,4-D和6-苄氨基嘌呤(BAP)的培养基上进行培养,诱导体胚形成和植株再生。结果表明,体胚诱导率和植株再生率因辐照剂量的不同表现出明显的差异,随辐照剂量的增加,外植体形成体胚的频率及再生植株的频率明显降低。推断快中子辐照花育22号的适宜剂量为9.7～14.0Gy。再生小苗经无菌嫁接驯化后移栽田间,得到了成熟种子。

狭叶柴胡营养器官中柴胡皂苷和黄酮类化合物的积累部位及含量比较

采用植物解剖学、组织化学定位和紫外分光光度计分析方法,对狭叶柴胡各营养器官(根、茎、叶)的结构特征、营养器官中柴胡皂苷和黄酮类化合物的积累部位及其含量进行比较研究。结果表明:(1)狭叶柴胡根由周皮、中柱鞘薄壁组织和次生维管组织组成,茎由表皮、皮层和维管柱组成,叶为等面叶结构,其营养器官的结构均表现出对旱生环境的适应性。(2)组织化学定位显示,柴胡皂苷在狭叶柴胡根中主要分布在维管形成层和次生韧皮部及次生木质部靠近维管形成层的木薄壁细胞中,在茎中主要分布在表皮、皮层、维管形成层及韧皮薄壁细胞中,在叶中主要分布于表皮和叶肉中;狭叶柴胡的黄酮类化合物在茎中主要分布于表皮、棱角处的厚角组织及部分皮层细胞中,在叶中主要分布于表皮和位于叶缘及下表皮内的厚角组织中,在根内分布很少。(3)定量分析表明,柴胡总皂苷在狭叶柴胡根、茎、叶中的含量分别为2.635%、1.045%和0.981%;而黄酮类化合物在根、茎、叶中的含量分别为0.032%、1.212%和2.259%;定量分析结果与组织化学实验结果相符。研究表明,柴胡总皂苷在狭叶柴胡的根中含量最高,支持《中国药典》以根入药的结论;而且狭叶柴胡叶中的黄酮类化合物含量较高,建议对狭叶柴胡的叶进行综合开发利用。

花生辐照变异新品系的选育

为丰富花生遗传基础,克服栽培遗传多样性差、高产优质专用新品种培育难以获得突破性进展的困难,本试验以花生品种鲁花11号干种子为诱变材料,采用^(60)Co-γ射线辐照处理,研究突变体后代性状表现。结果表明,突变体Y-21的M_2明显变异和分离,部分单株荚果明显变大,内种皮突变为金黄色。后代跟踪观察发现大果和金黄色内种皮能够遗传。对M7产量和品质的鉴定结果表明,从Y-21后代中选出的2个品系(大果和金黄色内种皮)Y-21-2-4和Y-21-3-2,其荚果形状、大小,籽仁形状,种皮和内种皮颜色等均符合传统出口型大花生的要求,且产量较高,其中Y-21-2-4比鲁花11号增产13.79%,比山东省区对照品种花育25号增产6.19%~7.70%,粗脂肪含量比鲁花11号高1.8个百分点,比花育25号高5.1个百分点。本研究获得的突变品系为花生育种及遗传研究提供了材料。

离体筛选花生抗逆突变体及其后代特征特性研究

在课题组前期研究确立的花生体胚诱导及高频率植株再生体系和确立的适宜平阳霉素(PYM)诱变浓度基础上,进行花生离体诱变及定向筛选抗逆突变体研究。以花生品种花育20号成熟种子胚小叶为诱变材料,在含3mg/L PYM的诱导培养基上培养4周进行诱变处理。以羟脯氨酸(HYP)作为筛选压力添加于培养基中,确定体胚萌发阶段培养基中添加4mg/L HYP,以及体胚萌发后添加8mg/L HYP为适宜浓度的筛选方法。2011年将获得的HYP耐性苗经嫁接移栽田间,成熟后13株耐性嫁接苗获得种子。2012年将13个单株的部分种子分别播种于田间,生长发育阶段观察发现,12个耐性植株后代在株高、茎枝颜色、株型、开花习性等方面与诱变亲本不同,明显表现出变异,并且大部分植株后代性状发生分离。13个耐性单株中的7个单株收获的其他种子分别播种于塑料大棚,苗期进行干旱处理后,大部分植株生长正常,而诱变亲本的生长明显受到抑制;取干旱处理后的叶片测定POD活性和SOD活性,结果显示,这7个耐性单株中的5个单株后代SOD活性高于亲本,这5个单株后代中的4个POD活性也高于亲本。

狭叶柴胡中黄酮类化合物含量及其动态变化研究

【目的】揭示不同物候期狭叶柴胡茎、叶等不同器官中黄酮类化合物含量及其动态变化规律,为其综合开发利用提供科学依据。【方法】采用紫外可见光分光光度法测定狭叶柴胡各器官中黄酮类化合物的含量,并比较不同物候期狭叶柴胡茎、叶中黄酮类化合物含量变化趋势。【结果】在狭叶柴胡不同器官中,黄酮类化合物主要积累在茎、叶、花及幼嫩果实中,其中以叶中的含量最高,为2.259%;而根和成熟果实中的含量很低,分别为0.032%和0.046%。在茎、叶的发育过程中,盛花期的黄酮类化合物含量最高,坐果时含量有所下降,果实成熟时含量又开始上升,至枯萎前期,两者的黄酮类化合物含量又恢复到一个较高水平。【结论】对狭叶柴胡中黄酮类物质的开发利用应重点选择叶片,并在狭叶胡植株枯萎前期采收其地上部分,以达到综合利用的目的。

以木糖异构酶基因作为选择标记的花生遗传转化

用木糖异构酶基因xylA替换掉pCAMBIA1301中的潮霉素磷酸转移酶基因(hygromycin-B-phosphotransferase,Hpt),构建了植物表达载体pCAMBIA1301-xylA。再利用农杆菌介导法将pCAMBIA1301-xylA导入花生,转移到添加蔗糖(5g/L)和不同浓度木糖(5,10,20,30g/L)的体胚诱导及体胚萌发培养基上培养。对外植体成苗率及转基因阳性率进行统计,结果表明,当木糖浓度为10g/L时,诱导成苗率为15.25%,再生植株生长健壮,且转基因阳性率高达77.27%,最终确定10g/L为最适木糖筛选浓度。该筛选方法利用木糖作为筛选剂,可以避免利用抗生素筛选可能造成的安全隐患,转化效率高,是一种安全、高效的筛选方法。

白花前胡营养器官结构及其分泌道分布规律的研究

运用石蜡切片方法,观察白花前胡营养器官的显微结构及其分泌道的分布特征,以明确营养器官内分泌结构的分布规律,为揭示白花前胡次生代谢产物的积累提供解剖学依据。结果表明,(1)白花前胡成长根从外到内由周皮、中柱鞘薄壁组织和次生维管组织组成,而且中柱鞘薄壁组织不同于一般双子叶植物根的结构;茎从外到内由表皮、皮层和维管柱组成;叶为异面叶结构。(2)白花前胡根、茎及叶中均有分泌道存在,分泌道在根中分布于中柱鞘薄壁组织和次生韧皮部中,茎中分布于皮层和髓中,叶中分布于维管束上下两侧的薄壁组织中。

平阳霉素离体诱变花生M_2农艺性状分析

以花生(Arachis hypogage L.)品种花育22号成熟种子胚小叶为诱变材料,培养在添加平阳霉素的体胚诱导培养基中进行诱变处理,将成活的形成体胚的外植体转移到添加NaCl的体胚萌发培养基中进行耐盐定向筛选。对获得的再生植株M2的部分农艺性状进行观察测定,结果显示,花生胚小叶经平阳霉素离体诱变和NaCl定向筛选获得的再生植株后代表现型存在广泛变异,如主茎高、侧枝长、分枝数、单株结果数、荚果形状和大小、种皮颜色等均发生明显的变异。从后代变异规律可以看出,利用高效低毒的平阳霉素作为诱变剂与组织培养结合可作为创造花生新种质的一种有效手段。

不同中药复方对山羊肉中氨基酸及脂肪酸含量的影响

本文旨在研究不同中药复方对山羊肉中氨基酸及脂肪酸含量的影响。试验选用体况良好、体重(24.09±1.25)kg的4月龄崂山奶山羊公羊20只,随机分为5组,即对照组和4个试验组,每组4只。对照组饲喂基础日粮,4个试验组在日粮中分别添加1.2%的复方紫锥菊提取物(试验Ⅰ组)、四君子散(试验Ⅱ组)、强壮散(试验Ⅲ组)和复方钩吻提取物(试验IV组)。结果表明:复方紫锥菊提取物和四君子散可显著提高羊肉中甘氨酸的含量,分别比对照组提高了13.13%和8.64%,提高肾周脂肪中油酸的含量,分别比对照组提高了3.72%和3.64%,也可降低背最长肌中硬脂酸的含量,且复方紫锥菊提取物组的降幅最大,分别比对照组、四君子散和强壮散组降低了9.74%、7.93%和10.39%。综上所述,复方紫锥菊提取物在提高羔羊肉品质方面效果最明显。

不同基因型对花生胚小叶植株再生的影响

以不同类型18个花生品种成熟种子的胚小叶为外植体,对不定芽诱导及植株再生进行了研究,旨在为花生遗传转化和离体诱变等提供培养方法。将胚小叶外植体培养在添加1mg/LNAA和6mg/LBAP的诱导培养基上,4周后转移到添加4mg/LBAP的培养基上进行培养。结果表明,所有的供试品种芽点诱导率均高于60%,但5大类型间及品种间（62.2%~95.5%）存在显著差异,龙生型平均诱导率最高（87.2%）,其次是珍珠豆型（81.5%）,多粒型最低（63.1%）。将形成芽点的外植体转移到添加4mg/LBAP的培养基上后,部分外植体从芽点上分化出不定芽,继续培养不定芽伸长并再生植株。植株再生率也存在显著性差异,最高的是珍珠豆型（83.5%~97.1%）,最低是多粒型（14.8%~22.0%）。