一株鹅源禽腺病毒4型的分离及致病性

2023年,昆明一朗德鹅场部分雏鹅出现软脖子症状,伴有零星死亡,病变疑似禽心包积液综合征(hydropericardium syndrome,HPS)。本研究旨在对本次雏鹅病因进行分子病毒学诊断和病原的致病性研究。采集肝病料接种鸡肝癌细胞(leghorn male hepatocellular cells,LMH):1)观察细胞病变效应(cytopathic effect,CPE),取培养液负染、电镜观察病毒粒子形态;2)靶标4型禽腺病毒(serotype 4 fowl adenovirus,FAdV-4)的衣壳蛋白编码基因hexon基因进行PCR诊断,对扩增基因序列进行遗传演化分析;3)以5×10^(5.5)TCID_(50)/羽的剂量皮下注射感染10日龄健康泰州鹅,进行动物回归感染以确证其致病性。结果显示,将病料上清接种LMH细胞48~72 h后CPE明显,细胞圆缩、间隙变大、随后碎裂、逐渐脱落,电镜观察见二十面体无囊膜病毒粒子;PCR检测FAdV-4阳性,分离纯化病毒,命名为YNKM2023株;hexon基因的遗传演化分析显示,分离株与国内已有的鸡、鸭FAdV-4流行毒株相似性高达99.8%~99.9%,与印度分离株相似性为99.5%~99.6%。接种感染后,泰州鹅未出现典型的临床症状,但感染后3 d开始出现HPS的特征性病变,感染后6 d检测到中和抗体。综上,本研究成功分离到鹅源FAdV-4/YNKM2023株,该毒株与国内已有的鸡鸭流行毒株高度同源,尚未发生明显的基因漂移。分离株可以感染鹅,病毒可以在雏鹅体内复制引起组织器官病变并产生免疫应答,对鹅表现出一定的致病性,这有助于了解FAdV-4在鹅群的流行情况及其对雏鹅的致病性。

1株鸡源鸭疫里默氏杆菌的分离鉴定及其生物学特性分析

为了解鸡源鸭疫里默氏杆菌(RA)的致病性,对1株2021年从病鸡肝脏中分离的RA疑似菌株进行染色镜检、生化鉴定、血清型鉴定、药敏试验、动物致病性试验及病理学观察并分析其16S rRNA序列。结果显示:菌株不发酵糖类,脲酶试验、触酶试验、氧化酶还原试验、明胶液化试验和枸橼酸盐试验均为阳性,硫化氢、VP、MR试验均为阴性;血清型鉴定为血清10型;分离菌对氨苄西林、阿莫西林、头孢噻呋、环丙沙星、磺胺异噁唑、红霉素、多西环素、氟苯尼考高敏,对头孢曲松、恩诺沙星、大观霉素、庆大霉素耐药;动物试验表明,能引起鸭和鸡的“三炎”症状,对鸭具有高致死率且能导致鸡出现严重关节软组织病变;病理学变化显示人工感染鸡心外膜增厚,充满纤维蛋白,炎性细胞浸润,主要炎性细胞为淋巴细胞;肝脏局灶性炎性细胞浸润,主要为淋巴细胞,部分肝细胞出现胞浆和核深染的固缩现象;脾脏血管周围有少量淋巴细胞浸润;腿部组织中充满渗出液,大量炎性细胞浸润于血管周围。16S rRNA序列比对显示分离株与GenBank RA参考株同源性均在99%以上,确认其为RA。遗传进化分析显示分离株与当前毒力最强的RA Hxb2株高度同源。本试验证明鸡源RA QD01株对鸡和鸭都具有强致病性并能在鸡群中流行传播。

恩诺沙星纳米乳的制备及抑菌活性研究

为了制备恩诺沙星纳米乳并确定其抑菌效果,试验采用低能乳化法中的相转变法制备恩诺沙星纳米乳,对制备的恩诺沙星纳米乳进行了乳液类型的判定、形态观察、粒径分布测定,研究存放时间、存放温度对制备的恩诺沙星纳米乳外观状态及粒径的影响,以及测定恩诺沙星纳米乳的抑菌活性。结果表明:以肉豆蔻酸异丙酯(IPM)为油相、聚氧乙烯蓖麻油-40(EL-40)为表面活性剂、乙酸为助表面活性剂,纯化水为水相制备的水包油(O/W)型恩诺沙星纳米乳外观澄清、透明,电镜下观察恩诺沙星纳米乳粒子呈圆球形,分布均匀,不粘连;粒径范围为10~100 nm,粒径大小在纳米乳标准范围内,乳液多分散系数(PDI)为0.192;8000 r/min离心15 min不分层,乳液性质稳定;10%恩诺沙星纳米乳对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径分别为3.72,2.71,3.82 cm,10%恩诺沙星可溶性粉为2.73,1.30,2.84 cm,10%恩诺沙星溶液为3.55,2.56,3.64 cm;10%恩诺沙星纳米乳对金黄色葡萄球菌和沙门氏菌抑菌效果较好,最小抑菌浓度(MIC)均为0.0625μg/mL,对大肠杆菌MIC为0.125μg/mL。10%恩诺沙星纳米乳对3种细菌的MIC与10%恩诺沙星溶液相当,差异不明显,均优于10%恩诺沙星可溶性粉。说明制备的恩诺沙星纳米乳性质稳定,抑菌效果比商品化可溶性粉好,与恩诺沙星溶液相当。

鸡传染性支气管炎·H9亚型禽流感病毒与鸡毒支原体混合感染的诊治

通过病理学解剖、细菌分离与培养、病毒分离鉴定、动物回归试验和分子生物学检测,对山东省日照市某发病鸡场5只病死鸡进行诊断。病理学剖检显示,病鸡支气管栓塞,气管喉头出血,肺出血水肿、颜色发黑,输尿管有尿酸盐沉积,气囊增厚、有干酪物渗出;从发病鸡组织中未分离出细菌;分子生物学检测结果发现,鸡传染性支气管炎病毒、鸡毒支原体和H9亚型禽流感病毒检测结果均呈阳性。经初步推断,发病鸡群存在鸡毒支原体隐性感染,又继发感染鸡传染性支气管炎和H9亚型禽流感病毒,多种病原混合感染造成鸡只死亡。建议该鸡场加强鸡传染性支气管炎和H9亚型禽流感防控措施,投喂抗病毒类药物。

银黄可溶性粉体外抗血清4型Ⅰ群禽腺病毒的试验研究

为探讨银黄可溶性粉体外抗血清4型Ⅰ群禽腺病毒(FAdV-4)的活性,应用MTT法与CPE法测定银黄可溶性粉对LMH细胞贴壁和单层生长的最大安全浓度,研究其对病毒增殖抑制、感染阻断和直接灭活的作用效果。结果显示,银黄可溶性粉对LMH细胞最大安全浓度为156.25μg/mL,在安全浓度范围内,加药组LMH细胞贴壁和细胞单层形成与细胞对照组无显著差异(P>0.05)。156.25μg/mL银黄可溶性粉体外抗FAdV-4效果最好,病毒增殖抑制、病毒感染阻断和直接灭活试验的细胞存活率分别为96.1%、122.0%、99.7%,病毒抑制率分别为91.5%、143.8%、99.3%,均显著高于病毒对照组(P<0.05)。此外,78.13μg/mL和156.25μg/mL的银黄可溶性粉体在病毒感染阻断试验中具有促进细胞生长作用。本研究为银黄可溶性粉用于因FAdV-4引起的鸡心包积液综合征的临床治疗提供理论依据。

一株禽腺病毒的分离鉴定及生物学特性研究

为了了解近期流行的禽心包积液-肝炎综合征病原的病原学特性和生物学特性,试验采用病毒分离、PCR结合测序鉴定及动物攻毒试验的方法对市场上发病鸡群的Ⅰ群禽腺病毒（FAdV）带毒状况进行了研究。结果表明：病料经卵黄囊接种鸡胚能终止鸡胚发育、胚体有点状出血、引发明显的鸡胚肝脏损伤,鸡胚死亡,死亡鸡胚可分离出病毒;分离毒经鉴定为Ⅰ群禽腺病毒4型,与GenBank中公布的FAdV-4毒株的核苷酸同源性为97.6%~100%,与之前国内分离株JSJ13的核苷酸序列一致;将分离毒通过肌肉注射30日龄健康易感肉鸡,5 d后鸡只出现死亡,攻毒后第9天死亡率为57.1%~85.7%,死亡鸡只解剖均表现典型的心包积液-肝炎症状。说明该分离毒具有致病性,与国内分离株JSJ13基因相比未发生突变,但与国外分离株存在一定差异,并且分离毒可成功复制出禽心包积液-肝炎综合征病例。

一株Ⅰ群禽腺病毒血清8b型的分离与鉴定

为了鉴定分离得到的毒株为禽腺病毒(Fowl adenovirus,FAdV)血清8b型,试验用LMH细胞对病毒进行分离,然后对分离毒株进行PCR扩增、hexon基因序列分析、TCID50测定、动物回归试验。结果表明:分离毒株在鸡肝癌细胞(LMH)中连续盲传3代后会稳定地出现明显的细胞病变,在接毒48小时时会出现特异的细胞病变,接毒72 h后有90%的细胞脱落,病毒毒价为1×10-8.1TCID50/0.1 mL。目的基因序列与GenBank中的Ⅰ群FAdV基因的核苷酸序列同源性为62.3%~93.4%,与GenBank中的Ⅰ群FAdV-8b毒株处于同一个分支,亲缘关系较近。在动物回归试验中,分离毒株可引起SPF鸡发病甚至死亡,发病率为100%,死亡率为20%。说明试验成功分离到了一株Ⅰ群禽腺病毒血清8b型毒株。

银黄可溶性粉对肉鸡人工感染IBDV防治效果的研究

考察银黄可溶性粉对鸡传染性法氏囊病的防治作用。以黄羽肉鸡为实验动物,按疗程饲喂高、中、低剂量的银黄可溶性粉,饲喂药物后第4天接种IBDV强毒,对攻毒后鸡死亡数、增重、剖检病变、免疫器官指数及IBD抗体等指标进行统计和分析。结果表明,在22日龄时,银黄可溶性粉以高剂量(每只鸡每天饲喂1.75 g)、中剂量(每只鸡每天饲喂1.0 g)饲喂3个疗程,对人工感染IBDV强毒的鸡群,保护率高于90%,有显著的防治效果,还能显著降低IBDV对鸡只增重的影响和对鸡法氏囊、胸腺和脾脏等免疫器官的损伤,且能减轻IBDV引起的机体免疫抑制,提高血清中的抗体水平。

一株禽多瘤病毒的分离鉴定及其VP1基因序列分析

从陕西某养鸟场发病鹦鹉幼雏体内分离到1株禽多瘤病毒(201808SX株),该病毒能在7日龄SPF鸡胚上繁殖,并呈现明显的胚体病变。通过克隆测序,获得了禽多瘤病毒(201808SX株)VP1基因全基因序列。同源性分析表明,201808SX分离株与不同地区不同时间APV分离株的VP1基因核苷酸同源性均较高,不低于99.4%,与2006年日本分离株、2009年中国潍坊分离株、2018年中国山东分离株和2018年中国C4-15分离株等同源性最高,均为100%。遗传进化分析表明,201808SX分离株在遗传进化上与2006年日本分离株、2009年中国潍坊分离株、2018年中国山东分离株、2018年中国C4-15株、2010年波兰分离株和2016年葡萄牙分离株处于同一小分支,均属于CladeⅡ分支。这是国内首次报道,将临床病料组织上清经卵黄囊接种7日龄SPF鸡胚成功地分离到APV,这为BFD的研究和防控奠定基础。试验结果也首次证实陕西地区虎皮鹦鹉中存在APV感染,丰富了国内APV流行的基础数据。

5株H9N2亚型禽流感病毒分离鉴定及HA基因的序列分析

[目的]对山东省部分地区疑似H9N2亚型禽流感病毒的5份病料样品进行鉴定,并确定其所属系谱。[方法]通过鸡胚接种、血清学试验、RT-PCR检测和基因测序等方法对样品进行分离、鉴定和分析。[结果]5个分离株与A/chicken/Guangxi/55/2005(H9N2)的同源性在90%以上,并属同一分支,与参考株A/chicken/Henan/G19/2011(H9N2)的同源性不到90.0%,与其亲缘关系最近的疫苗株A/chicken/Jiangsu/WJ57/2012(H9N2)的同源性在92.1~93.5%。[结论]分离的5个毒株均属于欧亚系Ⅰ群h9.4.2.5分支,且与参考株和疫苗株之间产生一定的遗传距离。

转移因子口服液对产蛋期蛋鸡安全性试验的研究

将三批转移因子口服液实验室制品对42周龄产蛋高峰期罗曼蛋鸡分别进行了单剂量给药、单剂量重复给药、超剂量给药的安全性试验。结果显示,转移因子口服液每羽灌胃给药0.5ml;每羽灌胃给药0.5ml、连续重复七次;以及每羽灌胃给药2.5ml后,经过14d观察与统计。

基因工程鸡α-干扰素纯化制品在鸡体内的消长规律

干扰素（interferon，IFN）是一类具有广泛生物学活性的蛋白质，具有调节机体免疫功能、抗病毒、抗肿瘤等多种作用，是机体防御系统的重要组成部分[1]。干扰素是在特定的诱导剂作用下，由细胞产生的一种具有高度生物学活性的糖蛋白，当它再作用于其他细胞时，使其它细胞立即获得抗病毒和抗肿瘤等多方面的免疫力[2]。α-干扰素是单核细胞产生的相对分子量18000的多肽，因其蛋白质分子的变异及肽链23位和34位氨基酸序列的组分不同，又可分为α2a、α2b、α2c等[3]。干扰素的活力具有相对的种属特异性，α-干扰素具有广谱的抗病毒活性，对DNA 病毒和RNA 病毒均有抑制作用[4]。