鸡肠炎沙门菌毒力蛋白SipD生物信息学分析及原核表达

【目的】预测肠炎沙门菌(Salmonella Enteritidis, SE)SipD蛋白的潜在生物学功能,并表达纯化该蛋白,为探索SipD蛋白作为抗沙门菌纳米抗体的候选抗原提供理论依据。【方法】利用DNAStar软件对GenBank中公布的不同血清型沙门菌株SipD蛋白氨基酸序列进行相似性比对,并通过在线软件对SipD蛋白进行生物信息学分析。根据GenBank中SipD基因序列设计引物,以鸡肠炎沙门菌标准菌株(ATCC 13076)为模板,PCR扩增SipD基因,构建pET-32a(+)-SipD重组质粒,并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。应用IPTG诱导重组SipD蛋白的表达,并利用Ni^(2+)亲和层析法纯化。应用SDS-PAGE和Western blotting检测SipD蛋白的表达情况。【结果】SipD蛋白在不同血清型沙门菌之间高度保守;SipD蛋白分子式为C_(1619)H_(2573)N_(441)O_(540)S_(8),无跨膜区,为膜外蛋白,不存在信号肽,该蛋白的第1~343位氨基酸具有来自超家族侵袭质粒抗原IpaD的保守结构域;SipD蛋白二级结构中α-螺旋、延伸链、β-转角、无规则卷曲占比分别为59.18%、6.41%、3.21%和31.20%;SipD蛋白与B细胞结合的抗原表位有12个。SipD基因长1 029 bp,在大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中以可溶性蛋白的形式表达;经纯化、透析、浓缩后蛋白浓度为8.6 mg/mL。SDS-PAGE和Western blotting分析发现,SipD蛋白纯度较高,可用于免疫羊驼制备纳米抗体。【结论】SipD蛋白为膜外蛋白,具有较多抗原结合位点;经表达纯化得到纯度较高的SipD重组蛋白,为进一步制备靶向鸡肠炎沙门菌SipD蛋白的纳米抗体提供材料。

二氢杨梅素对雏鸡免疫功能的影响

【目的】探究二氢杨梅素(DHM)对雏鸡免疫器官指数、免疫器官组织学形态及血清中免疫因子含量的影响。【方法】选取150只7日龄海兰白蛋雏鸡,雌雄各半,随机分为5组,每组30只,对照组给予基础饲粮,给药组分别在基础饲粮中添加0.025%、0.05%、0.1%、0.2%DHM。试验于给药7、14、21、28及35 d时,每组随机选取6只雏鸡心脏采血,收集免疫器官(胸腺、脾脏、法氏囊)分别称重,计算不同给药组雏鸡免疫器官指数,检测血清免疫球蛋白G(IgG)、补体(C3、C4)含量,并对给药35 d时雏鸡免疫器官进行HE染色观察组织形态。【结果】与对照组相比,0.2%DHM组在给药35 d时雏鸡胸腺指数显著升高(P<0.05),0.2%DHM组在给药28和35 d时雏鸡脾脏指数均显著升高(P<0.05),0.1%、0.2%DHM组雏鸡法氏囊指数在给药7 d时显著增高(P<0.05)。饲粮中添加DHM后雏鸡免疫器官细胞排列整齐、淋巴细胞数量增多、结构更加致密。与对照组相比,0.05%、0.1%、0.2%DHM组在给药28和35 d时雏鸡血清IgG含量均显著增加(P<0.05);各剂量组之间相比,0.2%DHM组雏鸡血清IgG含量在给药21和28 d时显著高于其他组,在35 d时显著高于0.025%和0.05%DHM组(P<0.05)。与对照组相比,0.1%、0.2%DHM组雏鸡血清中补体C3含量在不同给药时间均显著升高(P<0.05);各剂量组之间相比,0.2%DHM组雏鸡血清补体C3含量在给药14和28 d时显著高于其他组,在21和35 d时显著高于0.025%和0.05%DHM组(P<0.05)。与对照组相比,0.05%、0.1%和1.2%DHM组在14、28和35 d时雏鸡血清补体C4含量显著升高(P<0.05);各剂量组之间相比,0.2%DHM组雏鸡血清补体C4含量在给药14、21和28 d时显著高于其他组,在35 d时显著高于0.025%DHM组(P<0.05)。【结论】饲粮中添加0.2%DHM能促进雏鸡免疫器官生长发育,并且能提高雏鸡免疫因子的表达,增强雏鸡免疫功能。

二氢杨梅素对蛋雏鸡生长性能的影响

为研究二氢杨梅素(DHM)对蛋雏鸡生长性能的影响,选用7日龄海兰白蛋雏鸡150只随机分成5个组,每组30只。对照组给予基础日粮,给药组分别在基础日粮添加0.25、0.5、1、2 g/kg的DHM,试验期为35 d。结果显示,与对照组相比,42日龄时1 g/kg和2 g/kg的DHM组雏鸡平均体重显著增加(P<0.05);28和35日龄时0.5、1、2 g/kg DHM组平均日采食量显著或极显著增加(P<0.05或P<0.01);35和42日龄时0.5、1、2 g/kg DHM组平均日增重显著或极显著增加(P<0.05或P<0.01),肉料比显著增加(P<0.05);此外,DHM对雏鸡心脏指数、肝脏指数、肾脏指数和存活率均无明显影响。由此可见,DHM能够促进蛋雏鸡生长发育并对心脏、肝脏和肾脏无不良作用,可作为养禽业中一种绿色安全的饲料添加剂。

猪流行性腹泻病毒RT-LAMP快速检测方法的建立及应用

为建立一种适用于现场快速检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)的环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法,本研究以PEDV N基因的保守序列为靶基因设计引物,优化并建立了基于RT-LAMP的PEDV快速检测方法。结果显示,RT-LAMP方法的最佳反应条件为:反应温度为61℃,反应时间为50 min,Mg2+和dNTPs浓度分别为8.0 mmol/L和4.0 mmol/L,外引物和内引物最佳浓度比为1.4。特异性试验结果显示,该方法只能检测出PEDV,对其他病原检测均为阴性,具有良好的特异性;敏感性试验结果显示,该方法能够检测出的最低RNA浓度为6.52×10^(-5)mg/L,而常规RT-PCR能检测到最低浓度为6.52×10-3mg/L,表明RT-LAMP敏感性是RT-PCR的100倍;重复性试验结果显示,批内和批间重复性试验结果无明显差异,重复性较好。利用RT-LAMP和RT-PCR方法分别对3份已知阳性样品,5份已知阴性样品以及52份未知临床样品进行检测。阳性样品经RT-LAMP和RT-PCR方法均检测到PEDV,阴性样品均未检测到PEDV。52份临床样品中,RT-LAMP对PEDV检测阳性率为23.08%(12/52);RT-PCR检测阳性率为17.31%(9/52),二者的符合率为94.23%。以上结果表明,建立的RT-LAMP方法具有成本低、检测快、灵敏度高、特异性强等优点。且结果易于判定、便于现场检测,在病原检测方面具有良好的应用前景,为该病的流行病学调查及综合防制提供重要的实验依据。

猫干扰素α基因的克隆及其表达产物的抗病毒活性分析

为制备重组猫IFN-α并检测其抗病毒活性,本研究采用水泡性口炎病毒(VSV)感染结合poly I:C刺激实验猫后,提取猫脾淋巴细胞总RNA并反转录为cDNA,以其为模板经RT-PCR方法扩增获得了567 bp的猫IFN-α基因,测序后进行生物信息学分析。结果显示,猫IFN-α有21个潜在磷酸化位点、1个N-糖基化位点和8个O-糖基化位点,二级结构以α-螺旋为主。将该基因经BamH I/Kpn I酶切处理后克隆至pCold-TF载体,构建重组表达质粒pCold-α,将其转化大肠杆菌BL21感受态细胞后获得了表达猫IFN-α的重组大肠杆菌pCold-α/BL21。重组菌经IPTG诱导后SDS-PAGE检测结果显示重组猫IFN-α蛋白获得高效表达,采用His标签蛋白纯化柱纯化后得到纯化蛋白浓度为340 mg/L。以VSV和猫冠状病毒(FCoV)为模式病毒,采用微量细胞病变抑制法检测了重组猫IFN-α的抗病毒效果,结果显示,其抗VSV活性为5.91×10^(5) IU/mg,抗FCoV活性可达6.25×10^(6) IU/mg,具有良好的抗病毒活性。本研究为猫干扰素的开发应用奠定了物质基础。

猪传染性胃肠炎病毒单克隆抗体的制备及其在检测组织中病毒的初步应用

旨在建立一种在感染初期对猪传染性胃肠炎(TGE)进行快速准确诊断的方法。本试验使用猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)经蔗糖梯度离心后用于免疫BALB/c小鼠制备单克隆抗体,经4次亚克隆及Western blot、间接免疫荧光(IFA)鉴定后筛选出1株能够稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株3G11。通过试剂盒将3G11单抗与辣根过氧化物酶(HRP)偶联,然后以HRP-3G11作为一抗,利用免疫酶组织化学法检测小肠组织病料中的TGEV。结果表明:HRP-3G11作为一抗经镜检可见特异性红棕色沉淀,即HRP-3G11单抗可以与小肠组织中病毒发生特异结合,试验过程耗时少且可视化显色结果优于未标记一抗使用酶标二抗组,证实了标记后单抗HRP-3G11可以作为直接检测抗体应用于免疫酶组织化学法中检测用小肠组织中的TGEV。

猫白介素18基因的克隆、表达及其产物的生物学活性分析

白介素18(IL-18)可以诱导IFN-γ分泌,促进T、B淋巴细胞的增殖分化,具有良好的抗病毒活性。为探究猫IL-18的生物学活性,本研究采用水泡性口炎病毒(VSV)联合poly I:C共同刺激实验猫,采用常规方法分离猫脾淋巴细胞,提取总RNA,经RT-PCR方法获得大小为579 bp的猫IL-18基因。构建了可溶性表达猫IL-18的重组大肠杆菌pCold-IL-18/BL21,经IPTG诱导,SDS-PAGE分析结果显示,重组菌表达了约70 ku的重组蛋白。重组蛋白经3C蛋白酶处理后并通过Ni柱亲和纯化,获得了可溶性表达的重组猫IL-18(rIL-18)。取BALB/c小鼠和猫的脾淋巴细胞,经不同浓度rIL-18刺激,采用MTT法检测rIL-18促进淋巴细胞增殖活性,结果显示可溶性表达的rIL-18能够有效地促进淋巴细胞增殖;采用细胞病变抑制法检测rIL-18协同干扰素的抗病毒效果,结果显示rIL-18联合临床用干扰素可显著增强抗病毒效果。本研究为治疗猫病毒性疾病奠定了物质基础。

银杏内酯C对2种骨关节炎模型中软骨病理变化、基质降解和炎症反应的影响

基于大鼠关节疼痛、软骨病理程度、ECM降解过程和炎症介质生成水平,探究银杏内酯C(GC)对2种造模方式的软骨保护效果。选取25只Sprague-Dawley大鼠随机分为5组:对照组(Control组)、模型1组(ACLT组)、给药1组(ACLT+GC组)、模型2组(MIA组)和给药2组(MIA+GC组)。试验4周后,收集大鼠右后肢股骨、胫骨和血液样本,应用番红O固绿染色和OARSI评分对大鼠股骨和胫骨病理程度进行评估;免疫组化检测软骨中CollagenⅡ和MMP-13的表达水平;ELISA检测大鼠血清中MMP-3、MMP-13、CTX-Ⅱ、COMP、COX-2、INOS、IL-1β和TNF-α的水平变化;冷敏感性试验和伸膝发声试验检测大鼠关节疼痛程度。结果显示,与MIA组相比,ACLT可造成更严重关节软骨结构损伤。ACLT组中股骨和胫骨的OARSI评分、MMP-13的表达和血清中MMP-13、MMP-3、CTX-Ⅱ、COMP水平均高于MIA组;然而ACLT组中炎症介质COX-2、IL-1β和TNF-α水平显著低于MIA组(P<0.01)。GC干预后可降低OARSI评分(P<0.05或P<0.01)和疼痛评分,抑制ECM基质降解酶(MMP-13、MMP-3)、软骨代谢标志物(CTX-Ⅱ、COMP)和炎症介质(COX-2、INOS、IL-1β和TNF-α)的表达,并促进CollagenⅡ的合成。结果表明,2种造模方式均可造成软骨损伤,其中ACLT+PMMx法构建OA模型中大鼠关节损伤明显,有利于研究软骨结构损伤程度。GC干预后可减轻2组大鼠OA模型中关节疼痛、软骨病理变化、基质降解程度和炎症反应,从而发挥保护软骨作用。

愈创蓝油烃促进皮肤创伤修复的研究

为了探究愈创蓝油烃促进创伤愈合的机制,选取40只SD大鼠制作皮肤创伤模型,随机分为蓝油烃治疗组和模型对照组。于造模后第3、7、14、21天各处死5只大鼠,用ImageJ软件测量创面面积,计算愈合率。用Masson染色观察伤口胶原沉积量,用qRT-PCR检测VEGF、TGF-β1、FGF-7、EGF、HGF、Smad2和Smad3的转录水平,用免疫组织化学方法检测创面微血管再生情况,用ELISA检测IL-1α、MPO、PGE-2和TNF-α的表达水平。结果显示,愈创蓝油烃组的创伤愈合率高于模型对照组的。在用药后第3天,用qRT-PCR检测相关生长因子,结果显示,愈创蓝油烃组EGF的表达量显著低于对照组的,TGF-β1的表达量与对照组的无明显差异;第7天,Smad2的表达量与对照组的无明显差异;其余各时间点,愈创蓝油烃组VEGF、HGF、FGF-7、Smad3的转录水平均高于对照组的。由Masson染色结果可见在创伤愈合的整个过程中,蓝油烃处理组大鼠的胶原沉积率高于对照组的。由免疫组织化学检测结果可见在第3和7天时,蓝油烃处理组的创面微血管密度高于对照组的,第14天时则低于对照组的。ELISA结果显示第3和7天时,愈创蓝油烃组IL-1α含量低于对照组的,而第14天时略高于对照组的;于第3、7天时,愈创蓝油烃组MPO含量较对照组的略有下降,但在第14天时略高于对照组的;各时间点治疗组PGE-2水平均低于对照组的;治疗组大鼠TNF-α水平在第3天时略高于对照组的,在第7和14天时愈创蓝油烃组低于对照组的。结论:愈创蓝油烃可促进大鼠皮肤创伤愈合。其作用机制可能是通过调控伤口胶原蛋白的沉积、抑制IL-1α和MPO等炎症因子的表达和上调TGF-β1与FGF-7等生长因子的表达等促进伤口愈合。