高通量测序技术在低频突变检测中的应用

体细胞突变的累积与衰老、肿瘤及多种疾病的发生密切相关。在正常组织细胞中,基因组中自发突变和诱发突变的变异等位基因频率极低,对这类低频突变的检测一直面临挑战。第二代和第三代高通量测序(next-generation sequencing,NGS)技术的出现,可以实现任意物种全基因组上变异的直接检测,克服传统突变检测技术的诸多局限性。但是常规NGS由于测序错误率较高从而限制了其在低频突变检测上的应用,基于分子一致性测序策略进行错误矫正的高准确性NGS测序技术作为有效的低频突变检测工具,有望在环境诱变剂的评价与研究、细胞与基因治疗药物风险评估、人群健康风险监测和生命科学基础研究领域发挥重要作用。本文对比经典突变检测方法,对基于NGS的低频突变检测技术研究进展进行综述,并对应用前景进行展望,以期为该技术的进一步开发、研究和在相关领域的应用提供参考。

基于高通量测序技术的9种铁线莲属药材混合粉末分子鉴定

目的建立基于高通量测序技术的9种铁线莲属混合粉末分子鉴定方法。方法采用高通量测序技术,对9种铁线莲属药材混合粉末样品中的总DNA经提取,对ITS2片段进行PCR扩增,利用Illumina MiSeq平台对DNA片段进行双端测序,最后采用FLASH、QIIME、GraPhlAn及MEGA 7.0软件对序列进行整理并聚类分析,鉴定混合粉末中的物种。结果混合粉末样品中得到高质量的ITS2序列共496条,铁线莲属物种含有序列72条,比对出棉团铁线莲、女萎铁线莲、短尾铁线莲、灌木铁线莲、单叶铁线莲、黄花铁线莲、粗齿铁线莲等7个物种,未能比对出东北铁线莲和芹叶铁线莲。结论以ITS2作为DNA条形码,采用高通量测序技术,可以鉴定出铁线莲属药材混合样品中的7个物种,为混合药材的鉴定提供依据。

基于高通量测序技术对不同地区米酒曲微生物群落结构的分析

采用高通量测序技术对湖北宜昌当地传统米酒曲与广西玉林传统米酒曲中的微生物群落结构进行解析,获得了酒曲中主要微生物种属和占比。结果表明,广西米酒曲在物种丰富度以及群落多样性上均高于宜昌米酒曲;广西米酒曲中优势真菌属以根霉属(Rhizopus)、毛霉属(Mucor)、毕赤酵母属(Pichia)和假丝酵母属(Candida)为主,宜昌米酒曲中根霉属(Rhizopus)和毛霉属(Mucor)为优势菌属;在细菌属水平上,广西米酒曲以片球菌属(Pediococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、魏斯氏属(Weissella)、乳杆菌属(Lactobacillus)为主,宜昌米酒曲优势菌属为假单胞菌属(Pseudomonas)和魏斯氏属(Weissella);ASV/OTU韦恩图分析表明宜昌酒曲在物种独特性上要优于广西玉林酒曲。本研究揭示了宜昌传统米酒曲中的真菌与玉林传统米酒曲真菌菌种的差别,为逐步改善传统酒曲质量,以及相关微生物的进一步利用提供了理论指导依据。

高通量测序技术对杀菌型益生菌含乳饮料菌群结构分析

目的分析杀菌型益生菌含乳饮料中菌群组成结构,并探究宣称添加益生菌的真实性和合规性。方法本研究以高通量测序技术为基础,从市售11批次杀菌型益生菌含乳饮料中全基因组提取,进行V3/V4变异区序列的聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增后,整理及统计样品测序序列数目,操作分类单元(operational taxonomic unit,OUT)归类,生成稀释曲线、Alpha多样性、聚类、丰度分布曲线与分析菌群结构和菌种标示合规性。结果共得到39231条优质序列,分布在210~518 bp范围内;共注解到16个门、37个纲、71个目、129个科、265个属;从门分类水平主要为厚壁菌门(Firmicutes 91.66%),从纲的分类水平主要为芽孢杆菌纲(Bacill 90.43%),从目的分类水平主要为乳杆菌目(Lactobacillales 82.74%);优势菌种为德氏乳杆菌保加利亚亚种、嗜热链球菌;同时产品有检出携带致病性非益生菌菌群。11种产品标签标示与实际检测到菌株完全一致的仅有1批次。结论本研究建立的高通量测序技术能准确、快速地探究杀菌型益生菌含乳饮料中微生物菌群多样性和潜在的致病性,市售产品益生菌种类丰富,但同质化程度较高,产品间菌群分布均匀度差异大。

串联质谱联合高通量测序技术在新生儿遗传代谢病(IEM)筛查诊断中的应用价值

目的:探讨串联质谱联合高通量测序技术在新生儿遗传代谢病(IEM)筛查诊断中的应用价值。方法:回顾性分析本院2023年1月至2023年10月接收的3625例接受IEM筛查的新生儿的临床资料,对IEM患儿与正常新生儿的基本资料进行比较,并分析IEM新生儿的变异情况。结果:本组新生儿中基因变异共15例;IEM患儿与正常新生儿的基本资料差异无统计学意义(P>0.05);IEM相关基因变异的15例新生儿中,ACAD8基因复合杂合变异1例,SLC22A5基因变异携带者1例,前者被诊断为异丁酰辅酶A脱氢酶缺乏症,后者被诊断为原发性肉碱缺乏症;3例SLC22A5变异新生儿的游离肉碱水平(7.80±1.26)μmol/L明显低于3622例SLC22A5未变异新生儿的游离肉碱水平(18.95±3.25)μmol/L(P<0.05);4例MCC1/MCC2变异新生儿的丁二酰肉碱+3-羟基异戊酰基碱水平(0.48±0.08)μmol/L明显高于3621例MCC1/MCC2无变异新生儿的丁二酰肉碱+3-羟基异戊酰基碱水平(0.17±0.03)μmol/L(P<0.05)。结论:新生儿IEM筛查诊断中串联质谱联合高通量测序技术可取得确切的应用效果,对于存在基因变异携带的患者,要与其临床症状结合来开展诊断工作,避免出现漏诊的情况。

基于高通量测序技术老面酵头微生物菌群多样性分析

通过高通量测序技术对不同活化时间及活化次数老面酵头的微生物菌群多样性进行研究。结果表明,随着活化时间的增加,老面酵头的细菌菌群丰富度无显著变化(P>0.05),多样性呈先降低后升高的趋势,真菌菌群丰富度呈先升高后下降的趋势,多样性呈下降趋势;随着活化次数的增加,老面酵头的细菌菌群丰富度无显著变化(P>0.05),真菌菌群丰富度及细菌和真菌菌群多样性均呈下降趋势,说明活化对于老面酵头的菌群多样性具有不利的影响。不同老面酵头样品中相对丰度较高的微生物属具有一定差异。在门水平上,共检测出16个细菌门,优势细菌门分别为厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidota)和变形菌门(Proteobacteria);共检测出4个真菌门,优势真菌门分别为子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)和球囊菌门(Glomeromycota)。在属水平,共检测出195个细菌属,优势细菌属分别为乳杆菌属(Lactobacillus)和魏斯氏菌属(Weissella);共检测出46个真菌属,优势真菌属分别为哈萨克斯坦酵母属(Kazachstania)、交链孢霉属(Alternaria)和曲霉属(Aspergillus)。

高通量测序技术在粪便菌群移植中的应用

粪便菌群移植(FMT)作为目前治疗肠道菌群失调最为有效的手段,在艰难梭菌感染、炎症性肠病、肠易激综合征等疾病治疗方面发挥着重要作用。目前,RBX2660、Vowst等粪便微生物药物已获得美国食品药品监督管理局批准上市。高通量测序技术作为一项飞速发展的新技术,可通过扩增肠道菌群可变区的特定区段,分析菌群的组成、丰度等信息,为FMT过程中的供体选择、受体特征分析、效果监测等环节提供强有力的工具。高通量测序技术的应用可有力推动FMT的粪便制备过程质量控制、功能微生物确定、效果监测等方面的发展。本文旨在阐述和总结高通量测序技术在FMT领域的应用前景以及未来的发展趋势。

高通量测序技术在宫颈癌早期诊断中的应用

目的探讨宫颈癌早期诊断中运用高通量测序技术的临床价值。方法选择收治的45例宫颈癌患者为研究对象,通过采集宫颈脱落细胞、提取DNA,运用高通量测序技术对宫颈脱落细胞基因组进行测序,检测PIK3CA等与宫颈癌发生相关的基因突变情况,并且结合TCGA、COSMIC数据库信息判读宫颈脱落细胞的基因突变情况。结果45例宫颈癌患者中,42例患者检出基因突变,检出率为93.33%,鉴定出的突变基因共160个,其中PIK3CA占有较高的比例,其次为RB1、AKT2以及FAT1等。宫颈癌患者的基因突变类型包括拷贝数变异、插入缺失突变、移码突变、无义突变以及错义突变等,其中比较常见的是拷贝数变异和错义突变。同时,PIK3CA基因突变与患者的分化程度有关(P<0.05),但是与有无高危型HPV感染、淋巴结转移、组织学类型、临床分期、肿瘤大小以及年龄等因素无关(P>0.05)。结论宫颈癌患者中普遍存在基因突变,主要为多基因突变,其中PIK3CA是比较常见的一种突变基因,其信号通路以PI3K-AKT信号通路为主,并且运用高通量测序技术,能够及时发现新的一些基因突变,为早期诊断宫颈癌奠定理论基础。

靶向高通量测序技术在肺炎病原学诊断中的应用进展

肺炎病原学的临床诊断方法较多,传统检测技术存在检测范围有限、准确性欠佳、耗时长等不足。宏基因组二代测序(mNGS)技术检测范围广,但属于非靶向广谱病原学筛查,价格昂贵,临床应用受限。而靶向高通量测序(tNGS)技术可实现病原光谱精准检测,且检测成本更低。通过纤维支气管抽取支气管肺泡灌洗液,能直接取样,避免标本被口咽菌群污染,提高了病原学检测的准确性。因此,采用tNGS技术检测支气管肺泡灌洗液,能显著提升肺炎病原学的诊断效果。本文对tNGS技术在肺炎病原学诊断中的应用进展进行综述,旨在分析tNGS技术在肺炎病原学诊断中的价值,为tNGS技术的临床应用提供参考。

基于高通量测序技术探讨参曲健脾颗粒对脓毒症患者肠道微生态调节作用

目的探讨基于高通量测序技术探讨参曲健脾颗粒对脓毒症患者肠道微生态调节作用。方法收集2021年3月—2022年5月医院重症医学科脓毒症患者8例(脓毒症组),在医院体检选取年龄相匹配的正常对照患者5例(对照组),留取健康对照组早晨起床后的粪便。脓毒症组的患者在住院时间内实施常规的治疗,同时口服院内制剂参曲健脾颗粒治疗,留取脓毒症组患者入院第1、3、5天晨起后第1次粪便,采用高通量测序技术对两组粪便样本进行肠道菌群分析,区分样本后按97%的相似度进行运算分类单位(OTU)聚类。物种丰度用Chao指数评估,菌群丰度用Shannon指数评价。利用门、属水平的菌落组成和丰度信息进行差异菌群分析。采用ELISA法对两组研究对象入院的第1、3、5天C反应蛋白(CRP)血清淀粉酶和白细胞介素8(IL-8)、IL-10水平实施检测。检测健康对照组和脓毒症组患者入院第1、3、5天的CD_(4)^(+)及CD_(8)^(+)的百分比并计算CD_(4)^(+)/CD_(8)^(+)的比值。结果脓毒症组患者入院的第1、3、5天CRP、血清淀粉酶、IL-8水平均高于对照组(P<0.05),IL-10均低于对照组(P<0.05),且脓毒症组随着入院时间的增加,血清淀粉酶、CRP、IL-8水平降低,IL-10水平增高;对两组共23个样本进行测序,得到OTU 702个,多数样本中的OTU Rank曲线较为平缓并且分布比较地集中,各样本的菌种自身的均匀度及其内含菌种的丰度较相似;两组肠道菌群多样性指数分析结果显示,脓毒症组Chao指数、Shannon指数均低于对照组(P<0.05),且脓毒症组随着入院时间的增加,Chao指数、Shannon指数在增加;脓毒症组丁酸弧菌属、钌杆菌属、颗粒链菌属、螺旋杆菌属丰度高于对照组(P<0.05),拟普雷沃菌属、帕拉普菌属、罗姆布茨菌属、优杆菌属丰度低于对照组(P<0.05),且随着入院时间的增加,脓毒症组丁酸弧菌属、钌杆菌属、颗粒链菌属、螺旋杆菌属丰度降低,拟普雷沃菌属、帕拉普菌属、罗姆布茨菌属、优杆菌属丰度增加;脓毒症组CD_(4)^(+)、CD_(4)^(+)/CD_(8)^(+)水平均低于对照组(P<0.05),CD_(8)^(+)水平均高于对照组(P<0.05),且随着入院时间的增加,脓毒症组CD_(4)^(+)、CD_(4)^(+)/CD_(8)^(+)水平升高,CD_(8)^(+)水平降低。结论通过高通量测序的技术分析健康者及脓毒症患者粪便内的菌群,发现脓毒症患者的益生菌丰度降低,有害菌丰度增加,存在暂时性的菌群失调,经参曲健脾颗粒干预后,菌群的变化可恢复正常,且可减轻患者机体的炎症反应,改善免疫功能紊乱,提升脓毒症患者的肠道菌群多样性。

探析高通量测序技术在肺部感染性疾病中的应用进展

高通量测序技术也称二代测序技术(NGS),在临床中可作为多种病原体检测方法,具有准确性高、无偏倚等优势。肺部感染性疾病属于临床常见疾病,早诊断、早干预对挽救患者生命具有重要意义。但受临床抗生素不合理应用与患者个人情况影响,特殊病原体感染、重症感染及难治性感染的发生增加了诊断及治愈难度。这就要求对病原学微生物诊断方法进行深入研究,针对肺部感染性疾病诊疗现状,该文简要对NGS进行概述,并对NGS在肺部微生物群落检测、重症感染及特殊类型感染患者中的应用进展进行综述,探析NGS在肺部感染性疾病治疗中的应用。

高通量测序技术在病原体检测中的临床应用进展

病原体检测对临床诊断与治疗有着重要指导意义。当前临床病原学诊断方法主要有培养法、镜检法、PCR法、免疫学方法(包括荧光法、ELISA法、层析法)和测序技术等,其中以培养法结果阳性为“金标准”。但依赖传统方法仍有许多感染性疾病被漏诊。几乎所有的感染性疾病病原体都含有DNA或RNA基因组,因此基因组测序成为了病原体检测的一种极佳方法。

基于高通量测序技术的105例AML和MDS患者驱动基因突变谱差异性分析

目的获得西南地区急性髓系白血病(AML)和骨髓增生异常综合征(MDS)患者的基因突变谱特征,分析其差异性,探讨AML和MDS的差异性指标。方法回顾性分析2019年9月至2022年12月该院收治的71例AML患者和34例MDS患者的临床资料,将AML和MDS患者分别按年龄进行分组,年龄≥60岁纳入老年组,年龄<60岁纳入中青年组。患者住院期间均采用高通量测序技术进行基因突变谱检测,采用流式细胞术检测分化抗原。通过分析比较基因突变谱的特征,并结合细胞表面分化抗原,获得西南地区AML和MDS患者基因突变谱的差异性。结果AML和MDS患者老年组与中青年组的中位年龄比较,差异有统计学意义(P<0.05)。AML患者老年组男性比例较高,为76.2%,明显高于中青年组(P<0.05)。AML患者中DNMT3A的突变频率与年龄有关(P<0.05)。CEBPA、FLT3、RUNX1基因突变频率在AML中分别为23.9%、32.4%、9.9%,在MDS中分别2.9%、11.8%、26.5%,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论髓系白血病患者的基因突变频率与患者的年龄和性别有一定的关系;AML和MDS有特定突变位点和突变基因,可以将以上基因突变作为临床辅助鉴别诊断的有效指标。

基于高通量测序技术的广西咸梅细菌多样性分析

采用Illumina MiSeq高通量测序技术对广西地区9份咸梅样品的细菌多样性和群落结构进行解析。结果表明:咸梅样品中特有细菌种类较多但含量少,不同样品中细菌丰富度和多样性存在差异。优势细菌门分别为变形菌门(Proteobacteria)、硬壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes),平均相对含量分别为66.97%、21.50%、5.30%和4.20%,优势细菌属及其相对含量分别是雷尔氏菌属(Ralstonia)53.28%、乳杆菌属(Lactobacillus)10.36%、伯克氏菌属(Burkholderia)6.16%、诺卡氏菌属(Nocardia)2.74%、芽孢杆菌属(Bacillus)1.75%、假单胞菌属(Pelomonas)1.35%和另枝菌属(Alistipes)1.00%。在对优势细菌属进行相关性分析后发现,雷尔氏菌属(Ralstonia)与伯克氏菌属(Burkholderia)和假单胞菌属(Pelomonas)均呈显著正相关(P<0.05),芽孢杆菌属(Bacillus)与另枝菌属(Alistipes)之间存在显著正相关(P<0.05),还有部分优势菌属间存在拮抗或竞争关系,乳杆菌属(Lactobacillus)与雷尔氏菌属(Ralstonia)和伯克氏菌属(Burkholderia)均呈显著负相关(P<0.05)。

基于高通量测序技术分析不同原料海南酸瓜细菌多样性及食品安全风险

目的探究海南传统酸瓜的细菌群落结构,为发酵酸瓜的品质提升和食品安全防控提供理论基础。方法收集3种海南地区常见原料(小西瓜、哈密瓜、葫芦瓜)腌制的传统酸瓜,利用Illumina Miseq高通量测序技术解析其细菌多样性,并比较其差异,并对潜在的可利用微生物资源和引发食品安全风险的条件致病菌进行分析。结果不同原料发酵的酸瓜具有不同的细菌群落,3种海南酸瓜中优势细菌主要有乳杆菌属(Lactobacillus)、魏斯氏菌属(Weissella)、片球菌属(Pediococcus),其中乳杆菌属相对丰度占90%以上;同时,由哈密瓜制作的酸瓜中检测到了条件致病菌大肠-志贺菌属(Escherichia-Shigella)和克罗诺属(Cronobacter),存在一定的食用安全风险。结论海南酸瓜中蕴藏着丰富的乳酸菌菌群资源,为传统发酵食品产业资源发掘利用提供一定的理论基础和科学支撑,对影响食用安全的肠杆菌科等的防控也是发酵食品加工制作、储存销售过程中需要加强监管的一个重要方面。

基于高通量测序技术的葡萄表皮上细菌多样性研究

采用高通量测序技术对‘辽峰’‘阳光玫瑰’‘京亚’‘蓝宝石’四种葡萄表皮上细菌多样性进行研究.结果表明:在门、科、属水平上,四种样品的细菌群落结构存在不同程度的差异,其中‘蓝宝石’与其他三者之间差异最明显.相关性分析中,‘辽峰’‘阳光玫瑰’样品间细菌群落相似,‘蓝宝石’与其他三组样品间细菌群落差异较大.样品中丰富度较高的5种细菌操作分类单元(Operational taxonomic unit,OTU)分别为:红串红球菌Rhodococcus erythropolis、非保密无色菌Unclassified Achromobacter、Unclassified Mitochondria、Unclassified Chloroplast、约氏不动杆菌Acinetobacter johnsonii.

串联质谱与高通量测序技术联合检测在新生儿疾病筛查中的应用价值

目的探索串联质谱(tandem mass spectrometry,TMS)联合高通量测序技术(next generation sequencing,NGS)应用于新生儿疾病筛查中的价值。方法以长沙市2016年6月—2019年6月期间所筛查的62548例新生儿为研究对象,以TMS对其进行初筛,以NGS对初筛阳性病例进行鉴别诊断和基因诊断。结果62548例新生儿中初筛共存在794例阳性,经召回TMS检测后,共68例新生儿表现为阳性,对68例新生儿进行NGS技术检测后,仅24例新生儿确诊为阳性,总体发病率为1/2606。结论针对新生儿疾病的筛查,采用TMS联合NGS,能够尽早并有效地发现新生儿存在的遗传疾病,由此给予相应的干预治疗,从而提升新生儿质量。

高通量测序技术应用于稽留流产遗传因素的分析

目的采用高通量测序技术对稽留流产绒毛组织遗传因素进行分析。方法回顾性分析2017年6月至2020年6月清华大学第一附属医院因稽留流产行清宫手术的91例患者,对稽留流产绒毛组织进行高通量测序分析,分析绒毛染色体数目改变和拷贝数变异情况。结果91例稽留流产绒毛组织均进行高通量测序,70例(76.08%)染色体异常,其中染色体数目异常39例、嵌合体5例、拷贝数变异26例。拷贝数变异中微重复14例、微缺失6例、混合型6例。结论胚胎染色体异常是稽留流产的主要原因,以非整倍体为主,高通量测序技术拷贝数变异应用于绒毛染色体检测,具有较高敏感性,可增加染色体异常检出率,有助于明确稽留流产病因。

高通量测序技术对中国肺癌患者JAK基因表达的研究

目的研究发现JAK通路与肺癌患者对表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor,EGFR-TKI)的耐药有关,但JAK基因在中国肺癌患者中的突变情况尚不清楚,本研究旨在通过高通量测序技术了解中国肺癌患者JAK基因的表达情况,为肺癌的精准治疗提供依据。方法本研究收集来自北京泛生子基因科技有限公司在2017—2020年病理学明确诊断肺癌的14429例中国患者,其组织和/或液体标本采用高通量测序技术捕获测序JAK1、JAK2、JAK3和EGFR基因在标本中的突变模式。结果JAK家族基因JAK1、JAK2和JAK3在中国肺癌患者中的突变频率分别为0.55%(79/14429)、5.27%(760/14429)和1.67%(241/14429)。其中,JAK1最常见的突变为N339K(5例);JAK3的突变包括I688F(19例)和A573V(11例)。肺癌患者中JAK2基因最常见的热点突变是V617F(87例)。与EGFR共同发生突变的JAK1和JAK2突变频率分别为0.15%(22/14429)和1.17%(169/14429)。其中EGFR L858R所占比例最高(JAK1=0.10%,JAK2=0.69%)。结论本研究通过对中国肺癌患者基因组学的研究提示少部分患者存在JAK突变,且部分患者发生JAK与EGFR共同突变,靶向抑制JAK和EGFR有可能成为治疗EGFR-TKIs耐药肺癌的新途径,但还需要进一步研究证实。

基于16S rDNA高通量测序技术分析不同身体质量指数儿童的肠道菌群结构差异

目的 分析基于16S rDNA高通量测序技术分析不同身体质量指数儿童的肠道菌群结构差异。方法 选取2020年8月至2022年8月82例到许昌市中心医院进行健康体检的儿童作为研究对象,采用身体质量指数(BMI)分为正常组及肥胖组,采用16S rDNA高通量测序技术结合生物信息分析不同身体质量指数儿童肠道菌群丰富性和多样性指标及菌群的结构组成。结果 肥胖组的Ace指数和Chaol指数明显低于正常组,差异具有统计学意义(t=2.053、2.168,P<0.05);肥胖组的Shannon和Simpson指数较正常组低,但两组的差异无统计学意义(t=1.298、1.662,P>0.05)。儿童肠道微生物群落在门水平上排名的分别为:厚壁菌门>拟杆菌门>放线菌门>变形菌门。肥胖组的变形菌门明显高于正常组,差异具有统计学意义(t=7.019,P<0.05);但两组的拟杆菌门、拟杆菌属、乳杆菌属、大肠志贺菌属、放线菌门、双歧杆菌属水平比较,差异无统计学意义(t=1.897、1.977、1.662、1.818、0.468、0.227,P>0.05)。结论 不同身体质量指数儿童的肠道菌群的丰度不同,肥胖儿童的肠道菌群的丰度明显较低,且肠道菌群结构组成有差异,变形菌门可能是BMI升高的标志菌群,可能在儿童BMI升高中发挥着重要作用。