脂质体介导的cripto反义寡核苷酸抑制结肠癌细胞端粒酶活性

目的:探讨cripto反义寡核苷酸(ASODN)对结肠癌细胞端粒酶活性的影响。方法:应用脂质体瞬时转染法介导cripto反义寡核苷酸,处理人结肠癌细胞系后,分别采用实时定量PCR检测cripto mRNA表达,用TRAP检测端粒酶活性,采用软琼脂集落培养试验检测结肠癌细胞的生长。结果:Cripto ASODN可有效抑制结肠癌细胞集落生长,且与浓度相关。结肠癌细胞经Cripto ASODN转染后,端粒酶活性明显受到抑制,呈作用浓度和时间依赖性。并与ASODN的浓度和处理时间有关。结论:cripto基因可能参与对结肠癌细胞端粒酶活性的调控。

电刺激应激对C57 BL/6小鼠腹腔巨噬细胞产生白细胞介素1的影响

应激所致的免疫功能改变的机理认为与神经内分泌和免疫系统双向调节作用有关。鉴于白细胞介素1(IL-1)在这双向环路中的作用,促使研究电刺激应激对C57 BL/6小鼠腹腔巨噬细胞产生IL-1的影响。结果表明:应激6、12、20h后IL-1活性明显抑制,分别是正常活性的63.7±5.5％、59.2±4.8％、61.2±3.8％,P值均<0.01。而应激1、3 h后IL-1活性与正常无明显差异。我们进一步观察到:将应激6、12、20 h后的腹腔巨噬细胞在体外温育2、4、8 h后,再用内毒素诱生,随温育时间延长,巨噬细胞产生IL-1水平逐渐回升,8 h后IL-1活性基本恢复正常。上述结果提示:6 h以上电刺激应激抑制IL-1生成,但这种抑制在培养8 h条件下是可逆的。

RNAi沉默Polo-like kinase-1基因表达对大肠癌细胞端粒酶活性的影响

目的探讨polo-like kinase-1(PLK1)基因对大肠癌细胞增殖和端粒酶活性的影响。方法根据PLK1基因序列特点,设计并用化学方法合成小干扰核糖核酸分子(small interfering RNA,si RNA),转染人大肠癌SW480细胞后,分别采用实时定量PCR和Western blot检测PLK1基因mRNA和蛋白表达水平。分别采用MTT法和TRAP-ELISA方法检测PLK1基因转染对大肠癌细胞增殖和端粒酶活性的影响。结果所设计的5个si RNA均能明显抑制大肠癌SW480细胞PLK1 mRNA水平,以P4效果最好。以P4转染处理大肠癌细胞后,PLK1 mRNA水平和蛋白水平明显下调,且呈浓度和时间依赖性。MTT和TRAP-ELISA方法检测发现,P4si RNA转染组细胞增殖和端粒酶活性明显受到抑制,且呈浓度和时间依赖性(P<0.05,P<0.05)。结论PLK1基因对大肠癌细胞增殖具有重要的调控作用;以PLK1 si RNA转染处理大肠癌细胞,可明显抑制大肠癌细胞的恶性增殖,其机制可能与抑制端粒酶活性有关。

姜黄素对结肠癌SW-480细胞抗失巢凋亡的影响

目的:探讨姜黄素对结肠癌细胞抗失巢凋亡的影响。方法:采用不同浓度的姜黄素处理结肠癌SW-480细胞,采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP切口末端标记法(TUNEL)法检测结肠癌细胞抗失巢凋亡,采用软琼脂集落形成试验检测细胞的生长增殖。结果:姜黄素能有效地抑制结肠癌SW-480细胞锚着不依赖性增殖,且呈浓度依赖性。结肠癌细胞经姜黄素处理后,可促进失巢凋亡且与时间和浓度相关。结论:姜黄素可有效地抑制结肠癌细胞锚着不依赖性增殖,其机制可能与促进失巢凋亡有关。

多种小分子干扰RNA联合抑制乙型肝炎病毒的体外研究

小分子干扰RNA(siRNA)能够在哺乳动物细胞中引起包括病毒基因在内的基因沉默。为了研究多种siRNA联合应用在体外抑制乙型肝炎病毒(HBV)复制中的效果,本研究设计了12种针对不同HBV靶点的siRNA,转染可稳定分泌HBV颗粒的HepG22.2.15细胞,并采用了酶联免疫法检测上清液中HBsAg和HBeAg的含量,实时定量PCR法检测细胞中HBV的DNA含量。结果发现这12种分子均能在不同程度上抑制病毒复制。进一步研究表明它们对HBV的抑制作用在一定程度上存在剂量效应和协同作用,单分子siRNA在80nmol/L处对HBsAg和HBeAg的抑制率分别可达到约80%和60%,而多分子siRNA组合在20nmol/L处对HBsAg就能达到90%的抑制率,但对HBeAg表达的抑制率提高不明显。单分子siRNA在80nmol/L处对HBVDNA复制的抑制率可达到90%以上,而多分子siRNA组合在20nmol/L处对DNA含量就能达到约90%的抑制率。本研究的结果为进一步开发新的联合应用多种siRNA治疗HBV的途径打下了基础。

特异小干扰RNA敲除PLK1基因的表达

为了研究特异小干扰RNA(siRNA)作用于大肠癌细胞株SW 480中PLK1(Polo-like k inase 1)基因表达的mRNA对该细胞分裂生长的影响,设计了对应于PLK1基因表达mRNA不同位点的10种特异siRNA,经化学合成后,用脂质体转染SW 480细胞,实时定量PCR检测PLK1基因的表达,观察不同的siRNA作用强度,并计数细胞了解相应细胞的生长情况,W estern-b lot观察PLK1表达蛋白的变化和流式细胞计数分析细胞周期改变。发现10种siRNA均可敲除PLK1基因表达的20%以上,其中P1、P4和P9 3组敲除mRNA达80%以上,这3种siRNA及其混合物对PLK1基因mRNA的作用具有相应浓度效应,在25 nmol/L时达到最佳作用效果,而且相同浓度的混合物作用效果更好(超过95%),PLK1表达蛋白质明显降低,细胞周期在G2期受到阻碍。72 h后的各种siRNA浓度下细胞生长变化与PLK1基因的mRNA水平变化相一致。结果表明化学合成的特异siRNA对SW 480细胞中PLK1基因表达具有消除作用,混合物作用更强,在细胞水平上抑制了SW 480细胞的分裂生长。

急性白血病（M_4，M_5）单核细胞产生白细胞介素1的研究

本研究观察了脂多糖刺激正常人和急性白血病（Ｍ_４，Ｍ_５）患者单核细胞产生白细胞介素１（ＩＬ－１）的差别。结果表明：原代培养的白血病细胞能产生ＩＬ－１；但其产生ＩＬ－１水平明显低于正常人单核细胞水平，相差非常显著（Ｐ＜０．００１）；同时发现ＩＬ－１产生水平与白血病病程有关（发病期：４２２３．９±２６３．５ｃ／ｍｉｎ；缓解期：５６１４．３±４９３．４ｃ／ｍｉｎ，Ｐ＜０．００１）。提示：ＩＬ－１产生水平可以作为单核细胞分化程度的判别标准。

实时定量PCR分析ST13基因在肿瘤细胞株中的表达

目的 利用实时定量PCR(real timequantitativePCR)相对定量ST1 3基因在不同肿瘤细胞株的表达情况。方法 提取肿瘤细胞株SW 6 2 0、A5 4 9、Bxpc 3、SMMC 772 1、RKO和Bcap 37细胞总RNA ,经寡聚脱氧胸腺嘧啶逆转录 ,实时定量PCR扩增 ,针对内参照GAPDH基因相对定量ST1 3基因的表达 ,比较ST1 3基因在不同组织癌细胞株中的表达。结果 ST1 3基因在 6种肿瘤细胞株中表达高 ,相当于GAPDH基因表达的 1 %～ 2 0 % ,细胞株之间ST1 3基因表达量分高、中、低三类 (P <0 .0 5 ) ,呈现Bcap 37、RKO >SMMC 772 1和Bxpc 3>A5 4 9、SW6 2 0。 结论 本方法简便、快速、高效地反映了ST1 3基因在细胞株中的表达情况 。

针对PLK1基因mRNA的SiRNA治疗结肠癌的细胞学研究

目的研究小干扰RNA(Small interfering RNA,siRNA)处理结肠癌细胞株SW480,对该细胞存活生长的影响。方法化学合成了对应于PLK1(Polo-like kinase 1)基因表达mRNA碱基序列不同位点的3种特异SiRNA,分别用脂质体将其以及等比例混合物转染SW480细胞,MTT法检测不同的SiRNA对细胞存活的影响,并应用细胞染色和DNA电泳分析细胞凋亡。结果发现3种SiRNA及其混合物对SW480细胞的存活具有相应的抑制作用,随着浓度的增加SW480细胞存活百分率下降,而且混合物均比单一使用效果好,三种混合物在25nM处抑制了近20%的SW480细胞存活,同时观察到细胞形态和核酸变化的凋亡现象。结论化学合成的SiRNA降低了SW480细胞的存活,诱导了细胞凋亡,而且联合应用效果更好,提示新的抗肿瘤措施。

新基因HERV-H-X的env区分析及其在结肠癌组织中的表达

背景与目的:我们在结肠癌组织中发现了一个新的基因HERV-H-X。本研究的目的是分析HERV-H-Xenv区的缺失情况,研究其与其他HERV-Henv开放阅读框(open reading frames,ORF)的表达关系以及其在结肠癌与正常组织中的表达差异情况。方法:对HERV-H-X与含完整的envORF的HERV-H/env62、HERV-H/env60以及HERV-H/env59进行多序列比对,分析HERV-H-Xenv区的缺失情况。对HERV-H-X设计特异的引物,对HERV-H/env62、env60以及env59的envORF设计共同的引物,分别在8对结肠癌与相应癌旁正常组织中进行RT-PCR,比较它们的表达情况。对HERV-H-X进行实时荧光定量PCR,研究其在17对结肠癌与相应正常组织中的表达水平。结果:HERV-H-Xenv区缺失的序列正好相应于HERV-H/env62、env60以及env59的envORF区。RT-PCR结果显示HERV-H-X特异地在结肠的癌组织中表达,而HERV-Henv的ORF在结肠的癌组织与正常组织中都有表达。定量PCR结果显示HERV-H-X在结肠癌组织的平均表达水平是相应正常组织的24.9倍,经F检验证实差异有统计学意义(P<0.01)。结论:HERV-H-X的表达与结肠癌特异相关,但由于缺失env的ORF,其在结肠癌的高表达与env基因无关。

含LTR序列的psiTPTE22基因mRNA在肿瘤中的表达

目的:通过检测psiTPTE22基因编码的AK097082及BC031001的mRNA表达情况,确定其是否是基因芯片检测到的在结肠癌组织中高表达的基因,同时探讨该基因在癌症发生发展中的可能作用。方法:应用RT-PCR以及实时荧光定量-PCR法检测psiTPTE22编码的AK097082及BC031001的mRNA在肾、肝、胃、肺、结肠的癌组织和相应癌旁正常组织以及9个肿瘤细胞系和胎盘组织中的表达情况。结果:RT-PCR显示只有psiTPTE22编码的BC031001 mRNA在结肠组织中表达,但实时荧光定量PCR检测及F检验发现其在结肠癌与相应正常组织中的表达差异无统计学意义(P>0.05),因此psiTPTE22并不是基因芯片检测到的在结肠癌中特异高表达的基因。实时荧光定量-PCR还发现BC031001 mRNA在肾、肝、胃和肺的正常组织中高表达,而在相应的癌组织中表达较低;该mRNA在多个肿瘤细胞系中不表达或表达量很低;在胎盘组织中表达较高。对各组癌组织与相应癌旁正常组织的表达量进行F检验发现,肾、肝、胃、肺的癌旁正常组织和相应癌组织中的表达水平差异有统计学意义(P<0.05)。结论:psiTPTE22基因编码的BC031001 mRNA表达水平与多种癌症呈负相关性,但其原因及其在肿瘤发生发展过程中的作用还有待进一步研究。

人内源性逆转录病毒研究概况

人类内源性逆转录病毒（HERV）是几百万年前整合到人类基因组中的逆转录病毒的残余物，约占了整个基因组的8％。大部分HERV元件在进化过程中由于突变、缺失等的积累,已没有编码能力。但仍有少数由于正性选择的压力，完整的开放阅读框被保留了下来。它们在一些特定的组织或分化发育的特定阶段表面，可能具有重要的生理意义。而在某些疾病情况下的高表达水平提示其可能与疾病的发生发展相关。由于最初插入位点的关系或后来的转座作用，HERV元件相互之间以及对基因组中的其他基因都可能有影响。对HERV目前还了解甚少，该文将对HERV的生物学功能以及对HERV-K、-W、-H3个家族的研究概况作一简要综述。

白细胞介素1与炎症反应

白细胞介素1(interleukin 1,IL-1)主要由单核巨噬细胞产生,是分子量约为17kD的活性多肽,据其编码基因和理化性质的不同将它分为IL-1α和IL-1β两类。IL-1不仅是急性炎症反应的起动因子之一,而且参与慢性炎症反应,它还可作为一种激素,远程地作用于机体其它系统,协调机体各组织器官在炎症反应中的作用。本文就这些方面的进展作一概述。

Combination of small interfering RNAs mediates greater inhibition of human hepatitis B virus replication and antigen expression

Objectives: To evaluate the inhibitory effect mediated by combination of small interfering RNAs (siRNAs) targeting different sites of hepatitis B virus (HBV) transcripts on the viral replication and antigen expression in vitro. Methods: (1) Seven siRNAs targeting surface (S), polymerase (P) or precore (PreC) region of HBV genome were designed and chemically synthesized. (2) HBV-producing HepG2.2.15 cells were treated with or without siRNAs for 72 h. (3) HBsAg and HBeAg in the cell culture medium were detected by enzyme-linked immunoadsorbent assay. (4) Intracellular viral DNA was quantified by real-time PCR (Polymerase Chain Reaction). (5) HBV viral mRNA was reverse transcribed and quantified by real-time PCR. (6) The change of cell cycle and apoptosis was determined by flow cytometry. Results: Our data demonstrated that synthetic small interfering RNAs (siRNAs) targeting S and PreC gene could efficiently and specifically inhibit HBV replication and antigen expression. The ex- pression of HBsAg and HBeAg and the replication of HBV could be specifically inhibited in a dose-dependent manner by siRNAs. Furthermore, our results showed that the combination of siRNAs targeting various regions could inhibit HBV replication and antigen expression in a more efficient way than the use of single siRNA at the same final concentration. No apoptotic change was observed in the cell after siRNA treatment. Conclusion: Our results demonstrated that siRNAs exerted robust and specific inhibi- tion on HBV replication and antigen expression in a cell culture system and combination of siRNAs targeting different regions exhibited more potency.

小干预RNA对人乳头瘤病毒6bE6基因的沉默作用

目的探讨小干预RNA(siRNA)对稳定表达人乳头瘤病毒(HPV)6bE6基因的细胞株中靶基因的干预作用。方法建立并筛选稳定表达靶基因HPV6bE6的阳性细胞株,分别设计同源于HPV6bE6基因的不同序列的4对siRNA,采用实时定量PCR技术检测siRNA转染前后细胞内靶mRNA的表达情况。结果转染细胞中HPV6bE6基因表达最低有90%以上被抑制,低浓度siRNA水平(1nmol/L^150nmol/L)即能有效抑制靶基因表达,靶mRNA的沉默于转染siRNA后24h达到最强,且至少可维持4d。结论siRNA-HPV6bE6可以高效、特异地沉默HPV6bE6基因,可能为治疗HPV6b型感染提供实验室依据。

肺癌活检组织中Polo样激酶-1mRNA水平检测的临床意义

目的探讨实时荧光定量-聚合酶链反应(RFQ-PCR)检测肺癌活检组织 Polo 样激酶-1(PLK1)mRNA 水平,及其与肺癌临床病理分期、分型的相关性。方法对69份肺癌、28份肺良性疾病患者的纤维支气管镜活检标本,采用 RFQ-PCR 检测 PLK1和 GAPDH 荧光强度,并绘制曲线,计算出循环数阈值(Ct),相同组织中 PLK1和 GAPDH 的初始模板量的比值为2^(CtGAPDH-CtPLK1),同时以此值作为 PLK1 mRNA 水平的相对定量指标进行标本检测结果评价。结果肺癌组 PLK1 mRNA 水平为0.124±0.194,肺良性疾病组为0.037±0.042,两者差异有统计学意义(P=0.03)。而其在各病理类型和不同 TNM 分期之间的差异均无统计学意义(P>0.05),仅小细胞肺癌的表达水平略高(0.191±0.275)。结论 RFQ-PCR 测定纤维支气管镜活检标本中 PLK1基因表达增高与肺癌的发生存在一定关系,并且可能成为肺癌检测的一个肿瘤标志。

小干扰RNA抑制MG-63细胞cyclin A2基因的表达

目的利用小干扰RNA(siRNA)抑制骨肉瘤及正常成纤维细胞中cyclin A2基因的表达,并观察其对细胞生物活性的影响。方法设计并化学合成3对针对cyclin A2基因的siRNA,用Oligofectamine分别将其转染到骨肉瘤细胞系MG-63及正常人成纤维细胞HSF中,以无义siRNA转染作为阴性对照;以real-time PCR、Western blot检测cyclin A2基因沉默效果,采用MTT、RT-PCR、流式细胞、克隆培养等方法评价抑制cyclin A2基因表达后细胞的生长状态,同时检测PCNA及cyclin B1表达的改变。结果3对siRNA均能使cyclin A2 mRNA的表达降低,其中siRNA,抑制率最高。在骨肉瘤细胞MG-63中,转染50 nmol/L的siRNA,48 h后,cyclin A2的mRNA及蛋白表达被抑制近80%,这导致细胞增殖抑制,80.1%的细胞被阻滞在G0/G1期,克隆形成能力下降至45.5%,同时,PCNA及cyclin B1的mRNA表达明显降低。对正常成纤维细胞HSF,虽然siRNA1能抑制近60%的cyclin A2 mRNA及蛋白表达,但细胞的增殖及克隆形成能力未受影响。结论针对cyclin A2基因的siRNA能有效降低细胞中cyclin A2 mRNA及蛋白的表达,抑制骨肉瘤细胞的生长,而对正常细胞影响不大。表明cyclin A2是骨肉瘤细胞增殖所依赖的关键基因,抑制其表达有望成为治疗骨肉瘤的新途径。

白细胞介素1受体

白细胞介素1受体(IL-IR)介导了IL-1所有的生物学作用。用先进的分子生物学方法已证明,IL-I^R 是一条分子量约力80kD 的多肽,它的 N 端位于胞外,由319个氨基酸组成,主要功能是与 IL-1结合,C 端由217个氨基酸组成,位于胞内,其作用是与细胞内受体后信号转导系统相联系。每个正常细胞含 IL-lR 的数量较少,约在10～1000个结合位点之间。

结直肠癌组织cripto基因mRNA水平及临床意义

目的检测cripto基因mRNA在结直肠癌及其癌旁组织中mRNA表达情况，并探讨其在结直肠癌发生发展中的意义。方法提取36例人大肠癌及癌旁正常组织中总mRNA，采用实时荧光定量PCR法检测其中cripto mRNA表达情况；并分析其表达与患者淋巴结转移、肿瘤分化程度和Dukes’s分期相关性。结果cripto mRNA表达在大肠癌组织中阳性表达率为86．1％（31／36），而正常肠组织未见cripto mRNA表达，统计学差异显著（P〈0．0001）。criptomRNA表达与浆膜侵袭、淋巴结转移和Duke’s分期密切相关（P〈0．05，P〈0．05，P〉0．05），而与患者肿瘤发生部位和分化程度无关（P〉0．05，P〉0．05）。结论cripto基因在结直肠癌组织中高表达，可能与大肠侵袭痈转移有关。

小干扰RNA对人乳头状瘤病毒6bE7基因表达的沉默作用

目的研究靶向人乳头状瘤病毒HPV-6b型E7基因的二聚体小干扰RNA（siRNA-HPV-66E7）对靶基因表达的沉默作用。方法建立并筛选稳定表达HPV-6bE7基因的B16和293T转染细胞株，用脂质体转染法将体外合成的siRNA-HPV-6bE7转染上述细胞株，采用实时荧光定量PCR分析靶基因HPV-6bE7的mRNA表达情况。结果用不同浓度的siRNA-HPV-6bE7转染细胞48h，50nmol／L浓度对B16细胞中靶基因表达的抑制作用最强（抑制率87．05％），1nmol／L抑制作用较低（9．14％）；而在293T细胞，10nmol／L的siRNA对靶基因表达的抑制效应最大（78．87％），1nmol／L仍有一定抑制作用（46．92％）。50nmol／LsiRNA-HPV-6bE7转染B16细胞后，靶基因的mRNA表达在24h内开始受抑制（32．47％），48h作用最强（74．72％），96h作用很低（8．91％）；25nmol／L和10nmol／L的siRNA转染293T细胞后，均在24h内起效（26．66％、20．31％），抑制作用至少能维持72h（65．93％、35．23％）。结论siRNA-HPV-6bE7对B16和293T细胞外源性靶基因表达均有较强的特异性沉默作用，在不同细胞株达到最大抑制效应的siRNA浓度不同，但时效曲线的变化趋势基本一致，siRNA均在24h内起效，48—72h达到高峰，抑制作用至少能维持72h。本研究结果为下一步在动物或临床进行siRNA干扰试验提供了实验依据。