红曲霉繁殖相关wetM基因的克隆与生物信息学分析

红曲霉(Monascus spp.)是一类次级代谢产物极为丰富的食药用丝状真菌,其繁殖能力是大规模工业化生产的前提。以实验室保藏紫色红曲霉(Monascus purpureus)Mp-21为研究对象,通过高通量转录组(RNA-Seq)测序获得菌株转录本数据后进行注释分析,首次克隆出红曲霉繁殖相关wetM基因并进行生物信息学分析。wetM基因开放阅读框内(ORF)长度为1659 bp,负责翻译552个氨基酸,分子式C_(2605)H_(4067)N_(781)O_(831)S_(18),分子量60199.76,理论等电点(pI)8.15。进一步对wetM基因中的ORF序列分析得到的WetA蛋白与其他丝状真菌中的WetA蛋白在最后的90个氨基酸显示出极高的相似度,有一定的同源性,其保守结构域含有多个结构类型,属于非典型结构域。

棒曲霉孢子发育相关基因flbA的克隆和缺失突变株的鉴定

在模式真菌构巢曲霉中,FlbA蛋白位于分生孢子中心调控途径上游,对分生孢子的形成起激活作用.研究以1株实验室筛选的高产洛伐他汀棒曲霉Ac-32专利菌株的基因组为模板,克隆分生孢子发育相关基因flbA,用双接头PCR法构建flbA基因敲除盒,用根癌农杆菌介导转化法构建棒曲霉转化子库,依据转化子表型特征和分子特征鉴定flbA基因缺失突变株.结果表明:flbA基因全长为2208 bp,翻译对应的氨基酸为734个,理论分子量和等电点分别为78798.75 Da和8.64;棒曲霉与构巢曲霉flbA基因序列同源性为69.9%,氨基酸序列的同源性为76.6%;构建了flbA基因敲除盒和敲除载体,获得了258株棒曲霉转化子,经鉴定得到了1株flbA基因缺失突变株.研究成果为后续探讨棒曲霉flbA基因功能提供了材料,并奠定了理论基础.

紫色红曲霉Mp-21次级代谢产物抗氧化及抑制α-葡萄糖苷酶活性的研究

【目的】紫色红曲霉(Monascus purpureus)Mp-21次级代谢产物的分离纯化与生物活性研究。【方法】综合运用硅胶柱、反相C_(18)柱和Sephadex LH-20凝胶柱等柱色谱分离技术对紫色红曲霉Mp-21的次级代谢产物进行分离纯化,运用波谱学技术(核磁共振和高分辨质谱技术)鉴定化合物的结构。对鉴定的化合物进行抗氧化与降血糖相关酶抑制活性的测定。【结果】从紫色红曲霉Mp-21次级代谢产物中鉴定出10个活性化合物,分别为FMOC-ALLO-THR(TBU)-OH(1)、quercetin(2)、hesperetin(3)、monascin(4)、monasphilone A(5)、oleanolic acid(6)、β-sitosterol(7)、ergosterol(8)、indole-3-carboxylic acid(9)、chlorogenic acid(10)。其中化合物1为新天然产物,补充了该化合物在自然界中的信息和有机波谱信息,化合物2、6、9、10首次在红曲菌科中发现。在体外清除O2–、DPPH和OH–自由基的抗氧化活性试验中,化合物2(IC_(50)分别为5.07、4.84和27.39μg/mL)表现出较强的抗氧化能力。通过电子顺磁共振技术验证了化合物2对DPPH和OH–自由基具有较强的清除能力。化合物6对α-葡萄糖苷酶具有较强的抑制作用,IC_(50)为22.87μg/mL。【结论】紫色红曲霉Mp-21是极具开发性能的优质种质资源,具有开发成抗氧化、降血糖等功能性食品的潜力。

紫色红曲霉Mp-21胞内次级代谢产物的分离纯化与活性研究

【目的】紫色红曲霉(Monascus purpureus)Mp-21胞内次级代谢产物的分离纯化与活性研究。【方法】通过综合运用多种色谱分离方法对次级代谢产物进行分离纯化,最后通过多种图谱数据对化合物进行结构的解析与鉴定。对分离纯化得到的单体化合物进行抗氧化与降血糖相关酶抑制活性的测定。【结果】从紫色红曲霉Mp-21胞内分离纯化并鉴定出3个活性化合物baicalein(1)、genistein(2)、glycitein(3),其中化合物1为首次从红曲菌科中发现,化合物2和3为首次从紫色红曲霉中发现。在体外抗氧化和抑制酶活性试验中,化合物1对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、O^(2-)、OH^(-)自由基具有较强的清除能力,对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶也具有较强的抑制作用,IC50分别为5.67、17.46、36.40、30.94、430.93µg/mL。【结论】紫色红曲霉Mp-21具有开发成抗氧化、降血糖等功能性食品的潜力。

基于RNA-Seq分析MpigE在红曲霉色素生物合成中的转录调控

【目的】分析MpigE的缺失在转录水平对红曲色素产生的影响。【方法】对实验室保存的野生型紫色红曲霉(Monascus purpureus)Mp-21和△MpigE菌株进行高通量转录组测序、注释、表达差异基因功能富集分析和基因通路富集分析,在转录水平揭示MpigE缺失后红曲霉色素产量变化的原因。【结果】通过RNA-Seq测序,每个样品获得7.5–8.5 Gb的原始数据,经过拼接后得到7219个转录本(Unigenes),其中成功注释的为5692个。差异基因表达富集分析发现基因缺失菌株△MpigE相较于野生型菌株Mp-21上调差异基因达到199个,下调差异基因为293个。【结论】MpigE的缺失能够促进红曲霉中中央碳代谢和乙酰辅酶A代谢相关基因的表达以此影响色素生物合成。