妊娠山羊子宫uNK细胞与VEGF动态分布研究

探讨子宫内自然杀伤细胞(uNK)及血管内皮细胞生长因子(VEGF)在正常妊娠山羊子宫的动态分布规律。采用免疫组织化学技术对uNK细胞和VEGF在妊娠山羊子宫内的分布以及含量的动态变化进行研究,并通过RT-PCR技术检测VEGF mRNA的动态转录水平。结果显示:在妊娠早期,uNK细胞和VEGF大量存在于蜕膜部;妊娠中期,在子宫基质、腺体和肌层血管处检测到大量uNK细胞和VEGF表达;在妊娠后期,uNK细胞量和VEGF表达急剧减少。RT-PCR技术检测显示,妊娠早期和妊娠中期VEGF mRNA的转录量差异不显著,但均显著高于妊娠晚期VEGF mRNA的转录水平(P<0.05)。山羊子宫内uNK细胞和VEGF在妊娠不同时期的分布规律呈现一定相关性。

山羊子宫内膜细胞与性腺激素对uNK细胞分泌活性的调节作用

为探讨山羊子宫内膜细胞和性腺激素对子宫自然杀伤(uNK)细胞分泌血管内皮生长因子(VEGF)和γ-干扰素(IFN-γ)含量的影响。本研究以永生化山羊子宫内膜基质细胞(ESC)和上皮细胞(EEC)为体外研究模型,通过ELISA法检测子宫内膜细胞和性腺激素(E2和P4)对uNK细胞分泌VEGF和IFN-γ含量的影响。结果显示,在uNK细胞与EEC共培养时,雌激素E2单独或与P4共同作用可显著抑制uNK细胞中IFN-γ和VEGF分泌水平(P<0.05),而P4单独作用不显著;而当uNK细胞与ESC共培养时,孕酮P4单独或与E2共同作用可显著增强IFN-γ在uNK细胞中的分泌水平(P<0.05),而E2单独或与P4共同作用可显著抑制VEGF分泌水平(P<0.05)。研究结果表明性腺激素对与EEC或ESC共培养的uNK细胞分泌水平具有不同程度的调节作用。

稳定表达猪δ冠状病毒S1蛋白CHO细胞系的构建与鉴定

为构建稳定表达猪δ冠状病毒(PDCoV)S1蛋白的CHO细胞系,利用电转染技术将重组质粒pCGS3-S1转染至CHO细胞,通过有限稀释法筛选稳定表达重组S1蛋白的单克隆细胞系。利用阴离子交换层析和凝胶过滤层析方法对重组S1蛋白进行纯化,采用间接ELISA方法检测重组S1蛋白活性。将纯化的重组S1蛋白免疫BALB/c小鼠,通过间接ELISA、间接免疫荧光试验(IFA)及病毒中和试验对重组S1蛋白免疫原性进行检测。结果显示,稳定表达PDCoV S1蛋白的CHO细胞系成功建立,并获得了纯度高于90%、产量为28.5 mg/L的重组S1蛋白;且重组S1蛋白与PDCoV阳性血清反应性良好,具有良好的免疫原性,中和效价为1∶128。综上,成功建立了稳定表达PDCoV S1蛋白的CHO细胞系,且纯化获得的重组S1蛋白具有良好的生物学活性。

猪瘟病毒E2蛋白酵母表达及其免疫活性研究

猪瘟(CSF)是由猪瘟病毒(CSFV)引起的一种急性、热性、高度接触性传染病,呈世界性分布,对养猪业危害严重。猪瘟病毒属于黄病毒科、瘟病毒属,在自然条件下只感染猪。E2蛋白是猪瘟病毒的重要结构蛋白,也是猪瘟病毒的主要保护性抗原。以猪瘟病毒E2蛋白胞外区基因为模板,构建毕赤酵母表达载体pPICZαA-E2,并通过电转获得毕赤酵母X-33阳性克隆,经SDS-PAGE、Western blot鉴定筛选出猪瘟病毒E2蛋白表达菌株。通过亲和层析技术纯化蛋白,并将蛋白免疫动物,进行免疫原性分析。结果表明,猪瘟病毒E2蛋白在毕赤酵母中成功分泌性表达,经纯化纯度达95%以上;动物试验显示,该蛋白具有良好的免疫原性,为猪瘟病毒亚单位疫苗及相关检测技术的开发奠定了基础。

非洲猪瘟病毒H240R蛋白单克隆抗体的筛选与鉴定

为制备抗非洲猪瘟病毒(ASFV)H240R蛋白单克隆抗体,首先构建原核表达质粒pET-29b-H240R,再进行蛋白表达与纯化,随后免疫Balb/c小鼠,通过杂交瘤细胞技术制备、间接ELISA方法筛选获得单克隆抗体。结果显示,共获得4株杂交瘤细胞株,腹水效价均高于1∶40000;亚型鉴定结果显示,3株单克隆抗体(12D6、21G3、8G7)重链亚类为IgG2b,13D2重链亚类为IgG1,轻链亚类均为k。Western blot和Dot blot鉴定结果表明,21G3、13D2株单克隆抗体识别的抗原表位为线性表位,而12D6和8G7识别的是构象表位。间接免疫荧光试验(IFA)结果显示,4株单克隆抗体均能特异性识别HEK293T细胞中表达的H240R蛋白。制备了ASFV H240R蛋白单克隆抗体,为H240R蛋白的表位和功能研究奠定了基础。

新城疫病毒HN蛋白的酵母表达及其活性鉴定

为了制备新城疫病毒(NDV)HN蛋白并研究其免疫原性,将优化的HN基因胞外区插入毕赤酵母表达载体pPICZαA中,构建毕赤酵母表达载体pPICZαA-HN,并将其电转入毕赤酵母X-33感受态中,经PCR鉴定得到阳性转化子,甲醇诱导表达后,经SDS-PAGE和Western blot鉴定筛选出目的蛋白表达菌株;通过对诱导剂含量、诱导时间、培养基初始pH值和诱导温度进行优化,研究最佳表达条件;采用镍柱亲和层析对目的蛋白进行纯化,并用SDS-PAGE、Western blot和间接ELISA对目的蛋白进行鉴定;利用去糖基化酶PNGase F对目的蛋白进行处理,验证其糖基化修饰程度.结果显示,HN重组蛋白在毕赤酵母中成功表达,且在28℃ 条件下,培养基初始pH值为7.0,用0.5%甲醇诱导5 d,蛋白质表达量最高;通过镍柱亲和层析可获得纯度高于90%的重组蛋白;间接ELISA结果表明,重组蛋白活性良好;去糖基化试验验证了重组蛋白存在糖基化修饰.综上,利用毕赤酵母X-33成功表达了HN蛋白,且纯化产物纯度较高、活性良好,具有糖基化修饰.

猪伪狂犬病毒gE蛋白的酵母表达及其单克隆抗体的筛选

为获得具有生物学活性的猪伪狂犬病毒(PRV)gE蛋白及其特异性单克隆抗体,利用电转技术将pPICZαA-gE重组质粒转入毕赤酵母X-33并筛选出阳性克隆,通过SDS-PAGE、Western blot鉴定筛选出PRV gE蛋白表达菌株。通过诱导表达获得gE分泌蛋白,并利用Ni柱进行纯化,应用Western blot、Dot blot、ELISA方法对纯化蛋白进行活性鉴定。同时将纯化蛋白免疫BALB/c小鼠,细胞融合后通过免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)筛选单克隆抗体,并对单克隆抗体进行了反应性测定、效价测定及亚型鉴定。结果显示,PRV gE蛋白在毕赤酵母中成功表达,并获得了纯化蛋白,纯度达90%以上,且具有良好的生物学活性,与PRV阳性血清反应性良好;筛选到4株敏感性强、特异性良好的gE单克隆抗体,均可同时特异识别PRV gE蛋白及病毒,分别命名为2F10、4C10、9E1、10C3。综上,用酵母系统成功表达了PRV gE蛋白,并筛选到4株针对PRV gE蛋白的单克隆抗体。

禽腺病毒4型XZ株增殖与纯化方法的建立

2015年7月以来,禽腺病毒4型在中国的大部分地区暴发流行,并造成重大损失。为进一步对该病毒进行研究,采用两种方法对所分离的XZ株进行体外增殖培养,并利用透射电镜观察到完整的病毒粒子,同时采用超滤浓缩和凝胶层析的方法对病毒进行纯化。结果显示,成功建立了稳定的禽腺病毒4型XZ株增殖体系,以及温和、高效的病毒纯化工艺,且纯化病毒感染性强,具有很好的免疫原性。

噬菌体随机肽库筛选HPV45亚型L1蛋白抗原表位

高危型人乳头瘤病毒(human papilloma virus,HPV)可诱发女性宫颈癌,HPV45是HPV主要高危亚型之一,L1蛋白是主要的保护性蛋白。以大肠杆菌表达、纯化获得的重组蛋白SUMO-45 L1作为免疫原,通过杂交瘤技术制备抗HPV45 L1蛋白的单克隆抗体,并以单克隆抗体3C11为靶分子,使用噬菌体展示技术对随机十二肽库进行亲和淘选,三轮筛选后挑选12个与单抗3C11反应较强的克隆进行测序并分析。结果表明,噬菌体所展示的氨基酸序列与HPV45 L1蛋白序列“381VPNTYD386”相同,将其进行肽的合成,并通过斑点-酶联免疫吸附测定(dot enzyme-linked immunosorbent assay,Dot-ELISA)和间接竞争ELISA鉴定,最终鉴定出单克隆抗体3C11识别的L1蛋白线性表位“381VPNTYD386”。该表位的鉴定,为进一步分析HPV45 L1蛋白的结构和功能关系奠定了基础。