洛那法尼对动物源丁型肝炎病毒作用的初步研究

研究洛那法尼(Lonafarnib,LNF)对动物源丁型肝炎病毒(Hepatitis D virus,HDV)的影响,将完善对动物源HDV的认识,为进一步探讨其潜在致病性和传播特点奠定基础。利用点突变的方法对人源HDV复制模型进行改造来模拟动物源HDV的关键结构特征,利用转染、抗生素筛选的方法构建模拟的动物源HDV复制细胞模型,蛋白质免疫印迹法和间接免疫荧光法检测人源HDV复制模型改造后的HDV复制与蛋白表达情况,实时荧光定量PCR检测LNF对动物源HDV复制的影响。结果表明,改造后的HDV复制模型仍能在体外高效复制,可用于模拟动物源HDV的关键特征。与未处理组相比,LNF处理人源HDV复制模型后导致了HDV RNA的积累,而LNF对改造后的HDV样病毒的复制水平无显著影响。通过上述研究发现人源HDV与动物源HDV在病毒的生命周期和药物的作用效果方面均存在较大差异。

云南省鹤庆县首次在活鼠间发现鼠疫流行

目的通过对宿主动物及指示动物的流行病学调查,查明鹤庆县是否存在鼠间鼠疫流行。方法采用入户检诊检疫,搜寻自死鼠,同时笼捕法捕鼠;相应材料分别进行F1抗原抗体检测及细菌学检验。结果 (1)调查期间未发现自死鼠及疑似病人;(2)共捕获354只鼠,以大绒鼠(257只)及齐氏姬鼠(29只)为主;共分离鼠体蚤242匹,以方叶栉眼蚤(181匹)及特新蚤指名亚种(27匹)为主;(3)捕获鼠均为肉眼观察健康活鼠;(4)所得92份狗血清及4份鼠血清F1抗体检测阴性;(5)共分离鼠疫菌10株,其中大绒鼠6株、齐氏姬鼠1株、方叶栉眼蚤1株及特新蚤指名亚种2株。结论证实鹤庆县在活鼠间发生鼠疫流行,初步认为大绒鼠、齐氏姬鼠为主要宿主,特新蚤指名亚种为主要媒介;活鼠间的鼠疫流行是新发现的鼠疫流行形式。

云南省剑川县鼠疫疫源地分离菌株基因组多态性

目的阐明云南剑川野鼠疫源地鼠疫菌种群的演化及其与云南省其他疫源地菌株之间的遗传进化关系。方法按不同时间、不同疫点、不同分离源,随机选取24株剑川分离鼠疫菌进行研究;采用差异区段(DFR)、规律成簇的间隔短回文重复序列(CRISPRs)及多位点可变数目串联重复序列分析(MLVA)进行基因组多态性分析;以DFR+CRISPRs聚类分析划分簇,再以MLVA26对簇进行聚类分析。结果24株剑川菌株中,20株菌聚为一个簇(剑川野鼠鼠疫簇);2017年疫情分离3株菌位于丽江野鼠鼠疫簇,与丽江菌株(2017LZ)存在2个位点的差异(N2577,M23);剩余1株为一个独立株;50年代菌株与其邻近的80年代菌株间位点差异未超过3。结论剑川原野鼠疫源地的发现时间可往前推至上世纪50年代,同时疫情还波及过家鼠和人群;剑川县境内存在2种类型的野鼠疫源地,其鼠疫防控具有复杂性,应继续加强鼠间鼠疫的动态监测。

山东省高密市农村老年人生存质量影响因素分析

目的了解影响当前农村老年人生存质量的主要因素,为改善农村老年人生存质量提供参考依据。方法采用多阶段整群随机抽样的方法,在山东省高密市抽取5个乡镇,采用《农村老年人生活状态与生存质量调查表》对农村老年人进行问卷调查,运用logistic回归筛选可能的影响因素。结果与子女关系(OR=0.460)、年收入(OR=2.187)、患慢性病情况(OR=0.506)、饮酒情况(OR=1.306)和视力(OR=0.400)是影响农村老年人生存质量的主要因素。结论有针对性地开展农村卫生保健项目,加大对老年人生活补助的力度,积极有效地防治慢性病,弘扬孝道,加强子女的"反哺"意识,给老年人一个舒适的家庭环境,以提高农村老年人生存质量。

鹤庆新发野鼠鼠疫疫源地中鼠疫噬菌体的分离及其裂解谱测定

目的查明鹤庆新发野鼠鼠疫疫源地内是否存在鼠疫噬菌体,并对所离分鼠疫噬菌体进行形态鉴定及噬菌谱分析。方法以鹤庆县马厂村为核心,选择5km范围内的自然村为采样点,采用鼠铗法进行捕鼠,实验室中取鼠盲肠置入改良PBS中,采用双层平皿对样本进行筛选、纯化得到噬菌体,观察噬菌斑形态,电镜检查噬菌体形态,并在22℃、24℃、28℃及37℃对21株鼠疫菌与115株非鼠疫菌进行裂解特性分析。结果采集的354份标本,分离到2株鼠疫噬菌体;2株噬菌体在高于24℃温度下可裂解鼠疫菌,低于24℃不能裂解鼠疫菌,而非鼠疫菌在4个温度下均不裂解;电镜形态检测2株噬菌体均属于肌尾噬菌体。结论鹤庆新发野鼠疫疫源地内存在着鼠疫噬菌体,且所分鼠疫噬菌体只有在高于24℃时才裂解鼠疫菌,此特性与鼠疫菌在鹤庆县的长期存在相关,且两株噬菌体存在裂解谱较窄,特异性良好,可用于备用诊断噬菌体的筛选株。

快速检测炭疽杆菌的实时荧光定量PCR方法的建立及评价

为建立一种能快速鉴定炭疽杆菌的检测技术,本研究根据炭疽杆菌染色体上的TJHP和BA5345 2个靶点,分别设计4对引物和2个探针,对10份已知浓度的炭疽杆菌DNA和阴性对照菌株DNA进行检测,将浓度最大的炭疽杆菌DNA进行10倍倍比稀释,用于检测4对引物及其探针的灵敏度,并选出2个针对TJHP和BA5345靶点的特异性强及灵敏度高的引物和探针进行重复性实验。结果显示,4对引物及其探针特异性较强,FP2/RP2和FP4/RP4 2对引物的灵敏度为4.513×10^-5 ng/μL;该荧光定量PCR方法重复性好(t=1.178,P=0.332)。FP2/RP2和FP4/RP4 2对引物及其探针可用于炭疽杆菌感染初期的快速筛查以及临床辅助诊断。

2016年至2017年大理市第一人民医院感染性肺炎病原谱及耐药性分析

目的:分析住院患者肺炎病原谱及耐药分布,为临床治疗提供参考。方法:收集2016年5月至2017年5月大理市第一人民医院住院肺炎感染患者痰液,对痰液进行细菌培养分离、生化鉴定及药敏试验,统计分析病原谱及耐药性分布。结果:共分离到菌株287例,其中革兰阴性菌237例、革兰阳性菌43例、真菌7例;耐药结果显示,革兰阴性菌对厄他培南、亚胺培南、美罗培南、阿米卡星非常敏感(>98%),对庆大霉素、环丙沙星、左氧氟沙星、哌拉西林/他唑巴坦、头孢吡肟敏感率较高(80%<敏感性<90%);对氨苄西林、阿莫西林/棒酸、哌拉西林等敏感性较差(<60%)。革兰阳性菌对青霉素、红霉素、克林霉素、四环素耐药率高,其余敏感。结论:本次肺炎患者中分离的病原体以革兰阴性菌为主(82.58%);各类细菌都存在多重耐药现象;临床治疗必须结合病原学检测和药敏试验使用抗生素。

野生型鼠疫噬菌体YP060的分离和生物学特性鉴定

目的从鼠疫疫源地鼠巢中分离1株野生型鼠疫噬菌体（YP060）并分析其生物学特性。方法采用双层琼脂平皿法从云南省鼠疫疫源地鼠巢中分离鼠疫噬菌体；描述其形态特征；了解裂解能力、宿主谱、最佳感染复数、一步生长特性；分析不同温度和pH值、紫外线、氯仿对噬菌体的敏感性。结果YP060形态呈蝌蚪形，头部为正多面体结构，带有一伸缩的尾鞘；对鼠疫疫苗株EV76的最佳感染复数为0．1；潜伏期为50min，暴发期为80min；宿主谱评价显永，YP060仅裂解鼠疫疫苗株；YP060在30～50℃具有较强的热稳定性；pH值5～10范同内均有较强的裂解活性；对紫外线比较敏感；对氯仿不敏感，5％浓度的氯仿对其活性基本没有影响。结论本研究为国内首次从鼠疫疫源地鼠巢中分离到鼠疫噬菌体YP060，该噬菌体具有窄宿主谱和较强的生物学裂解特性。

云南省玉龙县鼠疫疫源地鼠疫噬菌体的分离及鉴定

目的 调查云南省玉龙县鼠疫疫源地宿主动物的鼠疫噬菌体携带情况，并对分离鼠疫噬菌体进行初步鉴定。方法 2016年，在春、秋两季，分别采集玉龙县鼠疫疫源地内5个鼠疫流行自然村的鼠类动物标本，以鼠疫疫苗株EV76为饲养菌，采用双层平板法分离鼠疫噬菌体，并鉴定噬菌斑形态。结果 ①春季采集动物标本409份，未分离到鼠疫噬菌体；秋季采集动物标本444份，分离到鼠疫噬菌体40株，分离率为9.01%（40／444）。②在5个鼠疫流行自然村均分离到了鼠疫噬菌体，各村间分离率比较差异无统计学意义（χ2 = 5.055，P 〉 0.05）。③在40株鼠疫噬菌体中，37株分离自齐氏姬鼠，2株分离自大绒鼠，1株分离自长尾大麝鼩。④分离鼠疫噬菌体的噬菌斑出现大（直径1.5 - 2.5 mm）、中（0.5 - 〈 1.5 mm）、小（〈 0.5 mm）3种类型。结论 云南省玉龙县鼠疫疫源地宿主动物携带较高数量的鼠疫噬菌体，噬菌斑形态多样，其生物学特性可能存在多态性。

一株分离自丽江野鼠疫源地鼠疫噬菌体裂解特性的研究

目的测定一株分离自丽江野鼠鼠疫疫源地鼠巢土的野生型鼠疫噬菌体(命名为LJ-7)的裂解谱,分析LJ-7的裂解能力及特点。方法采用双层平板法观察LJ-7对248株菌(包括10株云南鼠疫耶尔森菌、1株鼠疫疫苗株EV76、6株假结核耶尔森菌、37株致病小肠结肠炎耶尔森菌、17株非致病小肠结肠炎耶尔森菌、100株大肠埃希菌和77株其他菌株)在28℃、37℃及18℃3种温度时的裂解能力。结果 LJ-7对10株云南鼠疫耶尔森菌、1株鼠疫疫苗株EV76及1株弗氏志贺菌有裂解作用;对其余236株菌均不裂解。在37℃时LJ-7较鼠疫诊断噬菌体裂解性高,而在28℃时LJ-7较鼠疫诊断噬菌体裂解性低。结论 LJ-7在28℃、37℃及18℃时均能裂解鼠疫耶尔森菌,对弗氏志贺菌也有裂解性作用。表明LJ-7裂解细菌谱较宽,在不依赖鼠疫菌的情况下可由其他细菌提供营养而存在,它的发现对我国鼠疫疫源地环境微生态学和流行病学研究具有重要意义。

云南家鼠鼠疫疫源地指示动物中鼠疫噬菌体分离及其流行病学意义

目的调查云南家鼠鼠疫疫源地指示动物中是否携带鼠疫噬菌体,并探讨其流行病学意义。方法2015年11月至2018年3月,在云南鼠疫疫源地10个市(县、区)的26个乡镇,对41个村指示动物犬或猫进行肛拭子标本采集。以鼠疫疫苗株EV76为饲养菌,采用双层平板法分离鼠疫噬菌体,并对鼠疫疫源地鼠疫噬菌体的分离情况、不同犬类或猫的鼠疫噬菌体分离情况、噬菌体的噬菌斑多态性及鼠疫噬菌体宿主谱裂解情况等进行分析。结果共采集1014只指示动物,其中犬1003只,猫11只,分离获得102株鼠疫噬菌体;10个市(县、区)中只有澜沧县未分离到鼠疫噬菌体,其余9个市(县、区)均分离到了鼠疫噬菌体,分离率自高到低分别为宜良县(21.00%,21/100)、勐海县(19.23%,25/130)、元江县(11.63%,10/86)、弥渡县(11.50%,13/113)、文山市(10.10%,10/99)、弥勒市(7.07%,7/99)、梁河县(6.67%,7/105)、保山隆阳区(4.90%,5/102)及耿马县(3.81%,4/105)。102株鼠疫噬菌体中,有75株分离自土狗(中华田园犬),分离率为9.32%(75/805);20株分离自哈巴狗,分离率为13.70%(20/146);5株分离自狼犬,分离率为17.24%(5/29);1株分离自萨摩耶犬,分离率为1/4;1株分离自阿拉斯加犬,分离率为1/2。鼠疫噬菌体的噬斑出现完全裂解(背景清晰、透亮)、特大(2.5~4.0 mm)、大(1.5~<2.5 mm)、中(0.5~<1.5 mm)及小(<0.5 mm)5种噬斑;代表性噬菌体皆为肌尾噬菌体,大都能裂解鼠疫菌且部分噬菌体可裂解索氏志贺菌及5型假结核耶尔森菌(PST5)。结论云南家鼠鼠疫疫源地指示动物中存在鼠疫噬菌体,且分离的鼠疫噬菌体具有多态性。

云南省鹤庆县2017年分离鼠疫菌分子溯源

目的了解2017年云南省鹤庆县新分离的鼠疫菌的基因分型，为该地的鼠疫防控提供科学依据。方法采用差异片段（DFR）、规律成簇的间隔短回文重复序列（cRJsPRs）和多位点可变数目串联重复序列分析（MLvA）3种方法对10株鹤庆县新分离鼠疫菌进行分型，并将10株鼠疫菌及邻近疫源地鼠疫菌株93株纳入聚类分析。结果鹤庆鼠疫菌株与丽江鼠疫疫源地菌株具有相同的DFR型（Genomovar05型）及CRISPRs型（Ca7簇，22型），在MLVA聚类分析中，鹤庆鼠疫菌株与丽江野鼠鼠疫菌株位于同一个簇，两者之间仅有2个位点（N2117，M23）的差异。结论2017年云南省鹤庆鼠疫菌株与丽江野鼠鼠疫疫源地菌株具有很高的同源性，鹤庆县疫情可能是丽江鼠疫进一步向南扩散的结果。

剑川野鼠鼠疫疫源地鼠疫噬菌体的分离及其流行病学意义

目的 调查剑川野鼠鼠疫疫源地宿主动物中是否携带鼠疫噬菌体,并探讨其流行病学意义。方法 2017年1-6月采集剑川野鼠鼠疫疫源地4个曾流行过鼠疫乡镇6个自然村的鼠类标本,以鼠疫疫苗株EV76为饲养菌,采用双层平板法分离鼠疫噬菌体,并对分离结果进行流行病学分析,同时挑取部分噬菌体进行电镜扫描。结果 共获得641份标本(齐氏姬鼠334只,大绒鼠236只,其余71只),分离到9株鼠疫噬菌体,总分离率1.40%;有4个疫点(白山母村、石龙村、新松村、大庆村)分离到了鼠疫噬菌体,另外2个点(长乐村、西门社区)未分到鼠疫噬菌体;9株鼠疫噬菌体中,8株分离自齐氏姬鼠,1株自大绒鼠;初次分离这些鼠疫噬菌体时,其噬斑在双层平板上表现为大(直径～2.0 mm)、中(～1.0 mm)及小(<0.5 mm)3种噬斑;4株有代表性噬菌体皆为肌尾病毒科噬菌体。结论 剑川野鼠鼠疫疫源地中普遍存在鼠疫噬菌体,齐氏姬鼠是主要的携带宿主,所分鼠疫噬菌体为肌尾病毒科噬菌体且具有多态性,值得进一步研究。

基于分子网络方法分析2009—2017年中缅边境未治疗16~25岁HIV-1感染者流行特征

目的使用分子网络方法分析2009—2017年中缅边境的德宏州未治疗的16~25岁HIV-1感染者流行特征,为精准防控和降低HIV-1在德宏州的传播提供参考。方法筛选HIV-1感染者,静脉采血并分离血浆,提取RNA用以扩增HIV-1 pol区序列,使用HIV-TRACE程序构建分子网络并进行统计学分析。结果 573名入组感染者中,中国籍319名(55.67%)、缅甸籍254名(44.33%);男性351名(61%),女性222名(39%);异性性传播404名(HET,70.51%),注射毒品110名(PWID,19.20%),男男性行为者51名(MSM,8.9%);亚型包括独特重组型193个(33.68%)、流行重组型201个(CRF,35.1%)、C亚型156个(27.23%)、B亚型23个(4.01%)。通过HIV-TRACE构建的83个分子网络涉及249名感染者,86.7%的网络由CRF01AE,C或URF构成,49%为中缅混合网络(41/83),缅甸籍进入中缅混合网危险度高(AOR=2.676,p=0.002);中国籍男性PWID网络同配性为0.34,缅甸男性PWID为0.20,MSM为0.18。结论中缅边境德宏州存在潜在的HIV-1跨境传播风险;需注意MSM和缅甸籍男性PWID人群与其他传播途径混合传播的现象。

中国三省份未治疗HIV-1感染者临床毒株分离及其独特重组型的特征

目的分析未治疗的经性传播和注射吸毒感染HIV-1患者的病毒分离特征和独特重组型特征,为了解不同传播途径感染HIV-1的病毒生物学特性和精准防控提供依据。方法根据不同的HIV-1传播风险,筛选北京、广西、四川3个省市新诊断未治疗的HIV-1患者,静脉采血检测病毒载量、CD4^(+)T细胞计数,以及分离外周血淋巴细胞进行病毒分离,从病毒培养上清中提取RNA扩增全长序列,对序列进行分析。结果65名HIV-1感染者中,经男男性行为、异性性行为和注射吸毒感染分别为32(49.2%)、20(30.8%)和13(20.0%)例;亚型主要包括:26例(40.0%)CRF07C、23例(35.4%)CRF01E、9例(13.8%)独特重组型。共分离到46株HIV-1临床毒株,HIV-1分离阳性率与CD4^(+)T细胞显著负相关(χ^(2)=4.22,P=0.04),而与病毒载量正相关(χ^(2)=22.4,P<0.001);HIV-1的P24抗原含量多因素广义估计方程模型分析呈现类似结果。此外,广义估计方程模型显示P24抗原含量与培养时间正相关(52.14,95%CI:9.42~94.87,P=0.017),病毒生长曲线分析显示,在培养后第14天,男男性行为感染者的病毒P24抗原水平显著高于异性性行为和注射吸毒感染者(调整后P值分别为P<0.01和P<0.05)。9株独特重组型病毒均来自性传播感染者,男男性行为感染者中独特重组型的比例高于异性性行为感染者中的比例,且男男性行为感染者中的病毒基因重组断点多于异性性行为感染者。结论男男性行为感染者的血样对HIV-1病毒分离更敏感;性传播人群具有独特重组型多样性的特征,尤其是男男性行为感染者病毒基因重组更为明显。

云南省家鼠疫源地鼠疫耶尔森氏菌分子流行病学特征研究

目的探讨云南家鼠疫源地鼠疫菌在云南鼠疫菌遗传进化上所处的位置,及其种群流行演化规律。方法按照不同地点、时间及分离源随机选取186株家鼠疫源地鼠疫菌,采用差异区段(DFR)、规律成簇的间隔短回文重复序列(CRISPRs)及多位点可变数目串联重复序列分析(MLVA)3种方法进行分子分型分析;以DFR+CRISPRs双重方法聚类分析划分基因簇,以MLVA26对基因簇再次聚类分析划分亚簇。结果 186株家鼠疫源地鼠疫菌中的184株聚为一个簇(家鼠鼠疫簇),其余2株为独立株;近史流行期、复燃流行期和2016年疫情分离株分别处于不同的亚簇,它们之间的位点差异至少有5个;复燃流行期菌株共有5个亚簇和6个独立株,其中2个亚簇为主要的基因亚簇,即滇西亚簇和滇西南-滇东-广西-贵州亚簇,它们之间有4个位点差异。结论家鼠鼠疫菌是云南鼠疫菌中最晚出现的菌株,近史流行期菌株与复燃流行期菌株菌株存在较大差异,而复燃流行期的鼠疫流行是复燃和扩散并存的结果。

1株温和性噬菌体的发现及其流行病学意义

目的对云南省野鼠鼠疫疫源地齐氏姬鼠盲肠内容物中分离的1株鼠疫噬菌体(L128m)进行鉴定,探讨鼠疫自然疫源地微生态因素保存鼠疫自然疫源性发挥的作用。方法以鼠疫疫苗株EV 76为宿主菌,采用双层琼脂平皿法从云南省鼠疫疫源地齐氏姬鼠盲肠中分离1株温和噬菌体;描述其形态特征;测定裂解能力、宿主谱。结果鼠疫噬菌体L128m形成的噬菌斑中心和边缘均模糊,直径为0.9~1.0 mm,其为溶原性噬菌体;通过液体增殖培养后其效价达到106~P FU/ml;电镜观察其形态呈蝌蚪形,头部为正多面体结构,头部直径约为61 nm,尾部长约155 nm,带有一伸缩的尾鞘,归类为肌尾噬菌体。宿主谱评价发现仅裂解鼠疫疫苗株。结论从1只齐氏姬鼠盲肠内容物中分离的鼠疫噬菌体属溶原性噬菌体,它的发现对我国鼠疫疫源地宿主动物肠道微生态学和流行病学研究具有重要意义。

HIV-1 CRF07_BC病毒适应性的体外生长竞争试验的建立

目的:通过突变的方式构建含有鼠Thy1.1基因或鼠Thy1.2基因的HIV-1 CRF07_BC感染性克隆,建立CRF07_BC亚型体外竞争试验。方法:用鼠Thy1.1基因和鼠Thy1.2基因替换CRF07_BC亚型感染性克隆pXJDC6291-13 Nef区前218个碱基,构建成CRF07_BC感染性克隆BCEA1和BCEA2质粒。BCEA1和BCEA2进行293T细胞转染后获得病毒,测定病毒滴度,以等比例病毒含量共感染PM1细胞,在感染的第3、4、5、6天收集细胞并用Thy1.1和Thy1.2特异性抗体标记细胞,并进行流式细胞检测病毒适应性。通过"TFitness"程序(http://bis.urmc.rochester.edu/vFitness)计算病毒相对适应性。并观察耐药位点K103 N、多态性位点K166R相对于CRF07_BC亚型相对适应性的影响。结果:CRF07_BC亚型BCEA1和BCEA2两病毒的相对适应性(1+s)结果为1.06±0.23693,无统计学差异,建立了CRF07_BC亚型体外生长竞争性试验。利用该体外生长竞争试验验证K103 N和K166R突变株与野生株的相对适应性,BCEA2-K103 N/BCEA1相对适应性是0.728282±0.16608、BCEA2-K166R/BCEA1是0.883385±0.19023、BCEA2-K103 N+K166R/BCEA1是0.804604±0.06164。K103耐药位点突变株与野生株相对适应性存在统计学差异。结论:建立HIV-1 CRF07_BC病毒适应性的体外生长竞争试验,基于该体外竞争试验,HIV-1 K103 N的耐药毒株的病毒适应性降低。

实时荧光定量PCR检测布鲁菌的应用研究

目的 建立一种能快速检测布鲁菌的实时荧光定量PCR(RT-PCR)初步筛查方法。 方法 根据编码布鲁菌外膜蛋白omp10和omp31的碱基序列设计4对引物和对应探针,即omp10、omp10-1、omp31和omp31-1,应用实时荧光定量PCR技术,将设计的引物和探针分别用于检测6个种类的19份已知生物型的标准布鲁菌株DNA、10份云南玉溪分离的布鲁菌株DNA和224份阴性对照菌株DNA,包括35份巴尔通体菌、103份小肠结肠炎耶尔森菌(其中包括4份O∶3型和9份O∶9型)和86份杂菌,根据检测结果评价引物和探针的特异性。 结果 omp10、omp10-1可对19种标准布鲁菌株DNA进行扩增,omp10的起峰时间和扩增曲线优于omp10-1,且omp10不能扩增阴性布鲁菌株的DNA;omp31-1可对16种标准布鲁菌株DNA进行扩增;omp31不能扩增标准布鲁菌株DNA。omp10、omp10-1和omp31-1检测10份玉溪分离的布鲁菌株,DNA的平均循环(Ct)值分别为:19.87,、19.14、17.52。 结论 omp10特异性强,只对布鲁菌有特异性扩增,可用于布鲁菌的快速检测。