类风湿关节炎的潜在生物标志物及其免疫调控机制:基于GEO数据库

目的 探讨类风湿关节炎(RA)的潜在发病机制,挖掘可以作为RA早期诊断的生物标志物,并探究其可能的免疫调控机制。方法 依托GEO数据库多个基因组数据,利用limma包、RRA方法、批次矫正方法与clusterProfiler包筛选差异表达基因并预测其作用功能;通过STRING在线数据库得到蛋白质互作网络,利用Cytoscape3.8.0软件与GeneMANIA数据库筛选差异表达关键基因并预测其互作机制;构建ROC工作曲线验证关键基因诊断模型的信效度,并通过机器学习方法筛选疾病特征免疫细胞;使用corrplot包分析特征免疫细胞与疾病关键基因的相关性;使用GSEA富集方法探究关键基因生物学功能和相关性;通过构建胶原诱导性关节炎(CIA)大鼠模型探究具有较高诊断价值的差异基因在RA滑膜组织中的表达情况。结果 得到与RA密切相关核心关键基因9个,分别为:CD3G、CD8A、SYK、LCK、IL2RG、STAT1、CCR5、ITGB2、ITGAL,富集分析结果表明差异基因可能主要通过细胞因子相关通路调控滑膜炎症;ROC工作曲线分析表明9个核心基因的预测模型信效度较高,其中STAT1预测模型的AUC值最高(0.909);相关性分析结果显示,CD3G、ITGAL、LCK、CD8A和STAT1等5个核心基因与疾病特征免疫细胞相关性较强,其中STAT1与M1型巨噬细胞的相关性联系最强(R=0.68,P<0.001);CIA大鼠膝关节的HE、番红-O固绿染色结果表明关节炎大鼠造模成功且药物治疗有效,免疫荧光结果表明STAT1和磷酸化的STAT1在CIA大鼠踝关节滑膜组织中表达高于正常组和治疗组;免疫印迹实验结果表明,STAT1蛋白表达量在滑膜成纤维细胞的细胞核(P=0.0002)与细胞质(P<0.0001)中存在差异,且经过治疗,细胞核内p-STAT1与STAT1的蛋白表达量显著降低(P<0.0001)。结论 CD3G、CD8A、SYK、LCK、IL2RG、STAT1、CCR5、ITGB2与ITGAL等9个基因可作为RA的早期诊断生物标志物,CD3G/CD8A/LCK-γδ T细胞、ITGAL-Tfh细胞、STAT1-M1型巨噬细胞等基因-免疫细胞途径可能与RA的发生发展密切相关。

基于网络药理学探究加味甘草附子汤治疗类风湿关节炎的作用机制

利用网络药理学方法预测加味甘草附子汤(modified Gan Cao Fu Zi Decoction, GCFZ)治疗类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)的作用机制,通过动物实验验证分析结果并探讨GCFZ的药效学效果。首先利用TCMID、SymMap、HERB、STITCH和GEO数据库获取GCFZ治疗RA的靶基因,共筛选得到RA差异表达基因1 250个, GCFZ靶点基因534个,交集基因83个。随后通过GO和KEGG数据库对交集基因进行功能富集分析,发现GCFZ及其活性成分主要通过细胞因子通路发挥作用,其中趋化因子信号通路、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)信号通路富集基因数较多。接着使用Cytoscape3.8.0软件构建药物-靶点-疾病网络并筛选到TNF、趋化因子8 (C-X-C chemokine ligand 8, CXCL8)、趋化因子10 (C-X-C chemokine ligand 10, CXCL10)、趋化因子配体5(C-Cchemokineligand5,CCL5)、趋化因子2(C-X-Cchemokineligand2,CXCL2)、趋化因子受体4(C-X-C chemokine receptor type 4, CXCR4)等6个核心蛋白,并通过分子对接技术验证GCFZ主要活性成分与核心蛋白结合能力。通过构建胶原诱导性关节炎(collagen-induced arthritis, CIA)大鼠模型探讨GCFZ低、中、高(4、8、16 g·kg^(-1))剂量组的治疗效果, X射线影像学方法、HE染色、番红O-固绿染色结果显示, GCFZ干预能显著改善CIA大鼠骨质破坏、滑膜增生和软骨损伤,免疫荧光结果显示GCFZ治疗能够调节TNF、CXCL8、CCL5的表达。综上,本研究结果表明GCFZ含有多种小分子药效物质,能够通过多靶点、多通路发挥治疗作用,明显减轻CIA大鼠的关节炎症状。本研究动物实验获得蚌埠医学院实验动物管理和伦理委员会批准。