烟草基因组辅助育种研究进展

优质的烟草品种是促进烟草经济发展的基础。2010年以来,烟草基因组学迅速发展,推动了烟草遗传进化、功能遗传学等多个研究领域的进步,为烟草育种提供了新的工具和途径。本文总结了烟草基因组测序组装和功能研究的最新成果,从烟草遗传连锁图谱构建、数量性状基因座(QTL)定位、全基因组关联分析(GWAS)以及QTL定位和GWAS联合分析4个方面阐述了烟草分子标记辅助选择育种(MAS)的发展现状,并综述了全基因组选择(GS)和基因编辑(GE)的技术理论以及它们在烟草育种中的应用进展。针对目前烟草基因组辅助育种(GAB)存在的问题和不足,指出要充分利用烟草基因组信息,加快分子标记的开发,推进基因芯片的应用和加强高通量表型监测平台的建设,进而推进GAB在烟草育种上的应用。

烟草青枯病拮抗菌TBWR 1的筛选鉴定及防病促生能力

【目的】分离对烟草青枯病菌具有拮抗作用的细菌并对菌株进行分类、鉴定,以丰富烟草青枯病生防菌菌种资源。【方法】从健康烟株根际土壤中筛选拮抗菌株,测定其形态、生理生化特征及16S rDNA序列等,并对菌株进行分类鉴定,通过盆栽试验验证拮抗菌对烟草青枯病菌的拮抗活性及其对烟株的促生作用。【结果】在烟株根际土壤中分离获得1株对烟草青枯病有明显抑制作用的菌株TBWR1,序列基因登录号为EF562603,菌株TBWR1与枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis KC849252和Bacillus subtilis MN062963在同一分支上且同源性达85%,鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis);该菌株对烟草青枯病的生防效果达71.1%,并能显著促进烟草株高、叶长、茎围生长和根系生物量增加。【结论】枯草芽孢杆菌TBWR1可作为烟草病害生物防治的候选菌株,在烟草青枯病防治中具有潜在价值。

小麦单株产量与株高的QTL分析

【目的】在QTL水平上揭示株高与产量的遗传关系及株高对产量的影响,为小麦高产育种株高的选择提供参考依据。【方法】利用分别包含229和485个家系的2个关联重组自交系群体(recombinant inbred lines,RIL)潍麦8号/烟农19(WY)和潍麦8号/济麦20(WJ),绘制2个较高密度遗传连锁图谱。在3个环境下对单株产量和株高性状进行测量评价及非条件和条件QTL分析,研究株高与产量QTL的相互关系及排除株高影响后单株产量QTL效应的变化,探讨群体大小对QTL定位精度和准确性的影响。【结果】在WY群体中检测到5个单株产量QTL和15个株高QTL,其中,8个QTL解释大于10%的表型变异,3个为一因多效QTL;条件QTL分析表明,3个单株产量QTL与株高QTL无关,2个单株产量QTL的效应完全或部分由株高QTL所贡献,1个单株产量QTL的效应被株高QTL抑制。在WJ群体中检测到7个单株产量QTL和11个株高QTL,其中1个主效株高QTL加性效应值为8.82 cm,可解释20.68%的表型变异;条件QTL分析表明,5个单株产量QTL与株高QTL无关,2个单株产量QTL的效应完全由株高QTL所贡献。大群体WJ检测到的QTL效应值比小群体WY小,但LOD值高。【结论】株高与产量的关系是多重因素共同作用的结果,包括一因多效或紧密连锁、株高QTL对产量QTL表达的贡献与抑制、环境效应以及与其它性状的互作等。不同遗传背景、不同生态环境下株高对产量的贡献是各个因素相协调的结果,高产育种中对株高的选择在不同背景下应该有所区别;与小群体相比,大群体检测QTL的精度和准确性更高。

利用小麦关联RIL群体定位产量相关性状QTL

为定位控制小麦产量相关性状的QTL位点,获得与重要位点连锁的分子标记和染色体区段,以分别含有229个和485个家系的关联重组自交系(RIL)群体WY和WJ为材料,在4个环境中,用完备区间作图法(ICIM)对产量相关性状进行了QTL定位分析。结果表明,产量相关性状QTL分布在小麦21条染色体上。在WY群体中检测到每穗小穗数、主茎穗粒数、单株穗数、千粒重和单株产量的QTL分别有9、9、4、7和5个,其中16个(55.2%)解释大于10%的表型变异;在WJ群体中检测到这5个性状的QTL分别有20、16、11、14和9个,其中只有3个(6.7%)在单个环境中解释超过10%的表型变异。在WY群体中有5个QTL在2个环境中被重复检测到;在WJ群体中,有11个QTL在2个或2个以上环境中被重复检测到。在2个群体中均检测到产量相关性状的QTL在染色体上形成了含有一因多效或紧密连锁QTL的染色体区段,并在2个群体检测到可能相同的9对QTL和2个染色体区段。

番茄PPR基因家族的鉴定与生物信息学分析

PPR(Pentatricopeptide repeats)基因家族在植物中广泛存在,其在植物生长发育过程中至关重要。文章采用生物信息学方法,利用Pfam已鉴定的PPR保守结构域序列检索番茄(Solanum lycopersicum L.)基因组计划注释的蛋白序列,最终确定了番茄中可能存在的471个PPR编码基因;根据拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)中鉴定的各个结构域的特点对其进行了蛋白结构分析、分类和保守序列分析,并对番茄PPR基因家族进行了系统进化树构建、染色体定位、亚细胞定位预测、表达和GO分析等。结果表明:番茄PPR基因家族分为P和PLS两个亚家族,各占序列数目的一半,PLS亚家族又分为PLS、E、E+和DYW四类,且在进化树中形成不同的分支;各个结构域在植物中非常保守;PPR基因家族分布在番茄12条染色体上,且多数无内含子结构;大部分PPR蛋白具有线粒体或叶绿体定位序列,GO分析表明PPR蛋白参与RNA相关的生物学过程。

小麦关联RIL群体产量性状与品质性状的相关分析

为给小麦高产优质育种提供参考依据,以潍麦8号/烟农19和潍麦8号/济麦20构建的分别含229和485个家系的两个关联重组自交系(RIL)群体为材料,在三个环境下对12个产量相关性状和品质性状进行了分析评价。结果表明,小麦单株产量与其构成因素、每穗小穗数、株高和加工品质正相关,与蛋白含量等营养品质负相关,与抽穗期和开花期无显著相关性。产量构成因素间呈显著负相关,穗粒数和千粒重与每穗小穗数和株高正相关,而单株穗数与每穗小穗数负相关。穗粒数与蛋白含量和湿面筋含量负相关,与吸水率和硬度正相关。单株穗数与品质性状负相关,但多数未达到显著水平。千粒重与蛋白含量负相关,与湿面筋含量显著正相关。说明增加产量与提高蛋质白含量等营养品质确实存在矛盾,但高产和优良的加工品质不矛盾,二者可以协调。在育种中,可以通过调节产量构成因素实现与营养品质的协调,如千粒重和湿面筋含量可以共同提高。此外,各性状间的相关性在两个群体中略有差异,在不同环境中变化很大甚至相反,说明性状间的相关性受到遗传背景和环境因素(如土壤、气候、前茬等)及其互作的影响较大。

植物PPR蛋白家族研究进展

PPR(pentatricopeptide repeat)是一种三角状五肽重复结构域,具有该结构域的蛋白质家族是植物最大的蛋白家族之一,其在植物生长发育过程中发挥着广泛而且至关重要的作用。大部分PPR蛋白N端具有线粒体或叶绿体定位序列,是研究植物核质互作的理想模型。本研究从结构特征、亚细胞定位、组织结构和表达特点等方面总结了PPR蛋白的主要特征,归纳了其在叶绿体和线粒体RNA加工、细胞质雄性不育恢复、胚胎发育等作用机理方面的研究进展,分析了其家族进化关系,并对研究中存在的问题及可能的研究方向进行了展望。

NtabEXPA12基因过表达对烟草叶片发育及抗逆性的影响

细胞壁松弛因子膨胀素在调控植物生长发育和响应非生物胁迫等方面发挥重要作用,克隆烟草膨胀素基因并研究其功能可为烟草叶片发育调控和抗逆育种提供理论依据。本研究从普通烟草K326中克隆了一个膨胀素基因NtabEXPA12及其启动子ProNtabEXPA12,通过实时荧光定量PCR、亚细胞定位和过表达等对该基因进行了功能研究,分析了启动子包含的顺式作用元件和活性。结果表明,NtabEXPA12在烟草叶片中具有较高的表达量;ProNtabEXPA12中包含多个响应高盐、干旱和植物激素的顺式元件,并且其活性受到高盐、干旱和ABA等的诱导;过表达NtabEXPA12通过调控细胞扩展促进转基因烟草叶片的生长发育,并可以提高转基因K326对高盐和干旱的抗性。因此,NtabEXPA12在烟草叶片发育调控及抗逆育种中具有潜在的应用前景。

烟草GA代谢相关基因ga1和ga2的克隆和表达分析

为了解赤霉素(gibberellic acids,GA)在烟草生长发育中的作用,本研究利用同源克隆和RACE技术分离了3个烟草种GA代谢相关基因ga1和ga2的6条序列,对其进行了序列比对和进化分析;并利用荧光定量表达分析研究了其在林烟草和普通烟草中的表达谱。结果表明,相关基因在烟草属和茄科作物中保守性很高;普通烟草中克隆的ga1和ga2可能起源于绒毛状烟草。表达分析表明,ga1和ga2在林烟草生长发育早期和茎伸长期分别在叶和茎中的表达量显著高于其他组织。

冬小麦种质“矮孟牛”姊妹系遗传差异

采用田间试验鉴定和基因组分子标记分析相结合的方法,对冬小麦种质"矮孟牛"7个类型的性状和基因组遗传差异比较分析。结果表明,7个类型在调查的株高、穗长、穗粒数、粒长、粒宽、单株穗数等16个性状方面存在差异,其中矮孟牛V型的主要产量构成因素等性状比较协调,总体优于其他6个类型。在检测的2210对SSR、EST-SSR和STS标记中,有656对标记可在矮孟牛三亲本中显示多态性,将其用于矮孟牛7个类型全基因组遗传差异分析,并利用GGT2.0绘制7个类型的遗传差异图谱。在矮孟牛V型的1A、1B、2D、3A、4D、7A染色体上检测到8个特异位点,利用矮丰3号/牛朱特和孟县201/牛朱特构建的2个F2分离群体,经IciMappingV3.0单标记QTL作图分析,发现矮孟牛V型部分特异位点附近存在与产量构成因素等重要性状相关的QTL。矮孟牛V型的基因组特异位点可能是它作为骨干亲本区别于其他姊妹系的重要基因组特征。

普通烟草钙依赖蛋白激酶NtCDPK15的基因克隆及表达分析

钙依赖蛋白激酶(CDPK)对Ca2+信号转导通路下游元件的调控具有重要作用。本实验采用同源克隆技术从普通烟草中分离得到1个CDPK基因,命名为NtCDPK15(GenBank登录号为JN662020),cDNA全长为1963 bp,ORF大小为1569 bp,编码522个氨基酸。多序列比对结果表明,NtCDPK15的编码产物具有典型的CDPK保守序列,C末端调控区有4个EF手性结构。系统进化树分析显示,NtCDPK15可能来源于绒毛状烟草,预测NtCDPK15与NtCDPK1这对旁系同源基因在功能上可能非常保守。实时荧光定量PCR分析结果表明,NtCDPK15在根和叶中的表达量显著高于茎中的表达量,但经盐胁迫诱导后NtCDPK15在茎中的表达量显著增加,同时,盐胁迫还使基因在叶中的表达量显著上调,ABA胁迫可诱导基因在根中的表达,而干旱胁迫可使基因在根和叶中的表达量下调,这些结果说明NtCDPK15在普通烟草中的表达受盐胁迫及ABA胁迫诱导,但受干旱胁迫抑制。

基于SSR荧光标记分析我国主要审(认)定烤烟及白肋烟品种遗传多样性

将毛细管电泳荧光检测技术应用于烟草SSR标记研究，分析我国审（认）定通过的63份烤烟与8份白肋烟种质的遗传多样性。选取36对SSR引物，共扩增产生多态性带205条。运用NTSYS-pc2．10e软件计算Dice遗传相似系数，结果显示71份烟草种质的遗传相似系数介于0．223-0．924之间，平均为0．658。表明我国审（认）定通过的烟草栽培种间的遗传基础狭窄、遗传多样性不丰富。

烟草BRANCHED1-Like基因的克隆及表达分析

TCP转录因子家族CYC/TB1簇中成员BRC1在调控植物侧枝发育的过程中发挥重要作用。本研究利用电子克隆结合RT-PCR方法从普通烟草(Nicotiana tabacum)中克隆获得4个Nt BRC1-Like基因,分别命名为Nt BRC1-Like1、Nt BRC1-Like2、Nt BRC1-Like3和Nt BRC1-Like4。4条基因的CDS序列长度分别为1140 bp、1062 bp、987 bp和1041 bp,分别编码由379、353、328和346个氨基酸组成的蛋白,这4个蛋白与CYC/TB1簇中其他成员具有较高相似性。蛋白质保守结构域分析表明,4个Nt BRC1-Like基因编码的蛋白除具有TCP核心结构域外,还具有CYC/TB1簇蛋白特有的R结构域。系统进化树分析表明,Nt BRC1-Like蛋白都是TCP家族CYC/TB1簇中的成员,且4个Nt BRC1-Like蛋白可以被分成2组,Nt BRC1-Like1和Nt BRC1-Like4为一组,Nt BRC1-Like2和Nt BRC1-Like3为另一组。荧光定量PCR分析发现,4个烟草Nt BRC1-Like基因的表达呈现明显的组织特异性,且其表达模式可分为2种:Nt BRC1-Like1和Nt BRC1-Like4的表达模式相似,在腋芽中有极高的表达;Nt BRC1-Like2和Nt BRC1-Like3的表达模式十分相似,在叶和腋芽中的表达量都显著高于其他组织。推测烟草BRC1基因可能存在类似番茄BRC1基因在功能上保守与进化的情况。

不同生长物质复配处理对烤烟种子萌发的影响

为了更好地提高烟草催芽种子的质量,尤其是改善陈种子的萌发能力,实验采用不同浓度的MS营养液、GA3、IBA、6-BA及4者复配对K326、NC89新陈2类种子进行催芽处理,统计分析不同条件催芽处理后的种子萌发率、各项生理生化指标变化以及萌发相关基因的表达。结果表明,各因素单独催芽处理,在适宜浓度范围内均能促进种子萌发。而采用生长物质复配配方(1/20 MS+100 mg/L GA3+2 mg/L IBA+0.2 mg/L 6-BA和1/20 MS+100 mg/L GA3+2 mg/L IBA+2 mg/L 6-BA)催芽处理,种子萌发迅速且各项生理生化指标显著优于对照。此外,WRKY2基因的表达量在催芽处理后显著提高。

基于基因组的绒毛状烟草和林烟草microRNA及其靶基因分析

【目的】填补绒毛状烟草(Nicotiana tomentosiformis)和林烟草(Nicotiana sylvestris)在miRNA相关领域的研究空白,揭示普通烟草(Nicotiana tabacum)的生长发育调控机理。【方法】在绒毛状烟草和林烟草全基因组中预测并分析miRNA及其靶基因,通过同源比对及miRNA前体二级结构特征进行预测:参考序列在绒毛状烟草和林烟草基因组的比对中,允许最多1—2个错配;miRNA二级结构为经典茎环结构,其中MEF最大值为-25,MEFI最小值为0.85,预测的miRNA与已知的同一家族的miRNA位于发夹结构的同一条臂上;去除E值小于等于1e-6的编码蛋白的序列。【结果】在绒毛状烟草中得到39个家族的162条miRNA,包括14对正/反义miRNA和5个基因簇。在林烟草中得到40个家族的169条miRNA,包括13对正/反义miRNA和3个基因簇。2个野生烟草在保守度高的miRNA家族中,其成员分布相似,且成员数相近。在保守度相对较低的家族中,2个野生烟草其成员分布差异较为明显,其中,miR5021、miR5203等9个家族仅在绒毛状烟草中有成员,miR1446、miR1509等10个家族仅在林烟草中有成员。2种野生烟草的正义miRNA与反义miRNA都有着1—4个碱基差异,这些差异位点在不同的家族中呈现出偏好性,而且在2种野生烟草中偏好性相似:miR164家族的9、12、13个碱基处,miR172家族的1、21个碱基处,miR396家族的2、17个碱基处,miR399家族的15、20个碱基处。2种野生烟草的基因簇主要是由miR156、miR169家族组成,其前体的间距小于350 nt,同时在绒毛状烟草中首次发现miR6019/miR6020基因簇。以普通烟草的unigene数据库作为靶基因集进行预测与分析,在绒毛状烟草122条miRNA中得到749个靶基因,去掉重复基因得到非冗余靶基因206条,其中89条(43%)得到GO功能注释;在林烟草中117条miRNA得到650个靶基因,去掉重复基因得到非冗余靶基因169条,其中78条(46%)得到GO功能注释。在分子功能方面,大多数靶基因具有结合等活性。在生物学过程中,靶基因主要参与了发育过程、生殖过程、多细胞器官发育过程、胁迫应答过程等。【结论】控制发育和多细胞器官发育过程的靶基因数方面以林烟草居多,而胁迫应答的靶基因数以绒毛状烟草较多。

小麦重组自交系群体高分子量麦谷蛋白亚基组成分析

以潍麦8号与济麦20为亲本构建的重组自交系群体RIL-8的468个系为材料,利用SDS-PAGE技术检测分析了其高分子量麦谷蛋白亚基(HMW-GS)及亚基组合构成特点。结果表明:供试RIL-8群体在Glu-A1、Glu-B1和Glu-D1三个位点共检测到12种等位变异,其中Glu-A1位点2种,Glu-B1位点5种,Glu-D1位点5种;共检测到23种HMW-GS组合,其中2种亲本类型,21种新类型;不同HMW-GS和亚基组合在群体中的分布频率存在较大差异。

烟草青枯病抗性突变体486-K和117-K的遗传分析

烟草青枯病是一种典型的维管束细菌性病害,严重影响我国烟叶生产。为了解烟草青枯病抗性突变体的遗传规律和开发抗性相关分子标记,本研究选用EMS诱变烤烟品种翠碧一号获得的烟草青枯病抗性突变体486-K和117-K为研究对象,以翠碧一号和2个突变体为亲本,构建了两个不同的杂交组合,采用卡方检验和植物数量性状“主基因+多基因”混合遗传模型分析方法,进行群体遗传效应分析。结果表明,卡方检验显示突变体486-K和117-K的F2代各病级株数呈正态分布,存在一定性状分离。“主基因+多基因”混合模型分析发现突变体117-K的最优抗性遗传模型为2MG-A,即2对主基因为加性效应控制遗传,无显性效应和上位性效应,主基因的遗传效率为78.57%;突变体486-K的最优抗性遗传模型为2MGADI,即2对加性-显性-上位性主基因模型,上位性效应中以显性×显性互作和显性×加性互作效应较大,主基因遗传效率为88.34%。表明烟草青枯病抗性突变体的遗传方式以主基因效应为主,受环境影响较小。

烟草抗青枯病突变体153-K的抗性遗传及与农艺性状的关系

烟草青枯病是一种细菌性病害,严重影响烟叶生产,筛选抗青枯病的烟草种质并解析其抗性遗传效应对指导抗病育种具有重要意义。本研究选用感病品种翠碧一号(CB-1)和抗青枯病突变体153-K为亲本,构建了F2群体,利用“主基因+多基因”混合遗传模型分析方法,研究其在安徽、福建两个病圃环境下的遗传效应,并对153-K青枯病抗性与农艺性状进行相关分析。结果表明,153-K在安徽病圃中的最优遗传模型为MX2-EEAD-AD,即2对等显性主基因+加性-显性多基因模型;153-K在福建病圃中最优遗传模型为MX2-ADI-AD,即2对加性-显性-上位性主基因+加性-显性多基因模型。相关分析结果表明,在安徽、福建两个病圃环境下,青枯病抗性与株高呈显著负相关;而与叶片数、节距、茎围相关性均不显著。

烟草DXS基因的克隆及其亚细胞定位分析

[目的]从烟草cDNA中扩增出1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)基因(去除终止密码子TAA),并对其进行亚细胞定位分析。[方法]利用RT-PCR技术分离、克隆DXS,将烟草DXS基因与绿色荧光蛋白(GFP)基因重组构建亚细胞定位表达载体,转入根癌农杆菌LBA4404后注射侵染本氏烟烟草幼苗进行瞬时表达;并利用激光共聚焦扫描显微镜观察转GFP植株的表达情况。[结果]显微镜观察发现,DXS和GFP融合蛋白仅在本氏烟叶肉细胞(尤其是保卫细胞)的叶绿体中产生绿色荧光,DXS基因在叶绿体中特异表达。[结论]DXS定位在叶绿体中,为接下来对DXS基因功能研究提供了理论依据。

烟草NtbHLH112基因的克隆、鉴定及表达模式分析

bHLH转录因子在植物响应逆境胁迫过程中起着极为重要的调控作用,克隆和验证烟草中bHLH相关基因可为烟草抗性育种提供理论依据。本研究从普通烟草品种K326中克隆出一个NtbHLH112基因,通过生物信息学方法分析了NtbHLH112功能结构域,利用亚细胞定位及转录激活试验进行了功能鉴定,并利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析了其在不同逆境胁迫下的表达模式。结果表明,NtbHLH112具有典型的bHLH结构域且进化较为保守,定位在细胞核,具有转录激活的活性。进化分析表明,NtbHLH112与番茄Slb HLH112和辣椒CabHLH112同源。表达模式分析表明,NtbHLH112基因具有组织表达特异性,在叶部表达量较高,并且受到盐、干旱、冷胁迫及ABA处理诱导。因此,NtbHLH112转录因子可能在烟草非生物胁迫应答过程中发挥重要作用。