含hIGF-1基因腺病毒的构建及在兔骨髓间充质干细胞的表达

目的用Adeasy系统构建荧光蛋白基因标记的腺病毒载体Ad-hIGF-1,然后转染兔骨髓间充质干细胞并检测其表达。方法根据GenBank公布的hIGF-1序列设计PCR引物,从质粒pcDNA3.1-hIGF-1中扩增出截短型hIGF-1,亚克隆至pMD-T载体,鉴定后酶切出目的基因插入pAdtrack-CMV中构建成腺病毒穿梭质粒pAdtrack-hIGF-1,经Pm eⅠ线性化后采用电穿孔法转化至已包含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的B J5183大肠杆菌中,挑选同源重组质粒线性化后转染HEK293细胞收获腺病毒,然后转染靶细胞兔骨髓间充质干细胞,通过绿色荧光蛋白表达情况以及流式细胞仪、免疫细胞化学等方法检测hIGF-1的表达。结果成功构建了绿色荧光蛋白基因标记的腺病毒Ad-hIGF-1,并在兔骨髓间充质干细胞得以高效表达。结论Adeasy腺病毒系统是基因转染的高效载体系统。腺病毒Ad-hIGF-1转染的骨髓间充质干细胞可作为基因修饰的软骨组织工程种子细胞。

hIGF-1基因修饰骨髓基质干细胞复合PLGA移植修复关节软骨缺损

目的:研究人胰岛素样生长因子-1(hIGF-1)基因修饰的骨髓基质干细胞(MSCs)复合PLGA材料移植对关节软骨缺损的修复作用。方法:从质粒pcDNA3.1-hIGF-1中扩增出hIGF-1基因,亚克隆后酶切出目的片段插入pIRES2-EGFP中,构建成真核表达载体pIRES2-EGFP-hIGF-1,鉴定后转染兔MSCs并检测hIGF-1在其中的表达;将转染细胞复合PLGA支架材料立体培养后植入实验性兔关节软骨缺损处,不同时间取材,检测对软骨缺损修复的效果。结果:成功构建了GFP标记的真核载体pIRES2-EGFP-hIGF-1,并在靶细胞中得到理想表达;hIGF1基因修饰的MSCs复合支架材料移植明显促进了缺损软骨的修复质量,组织学评分与对照组相比有统计学差异(P<0.05)。结论:IGF-1是软骨组织工程种子细胞MSCs基因修饰的理想候选基因,以之修饰的MSCs作为种子细胞可以明显提高组织工程方法对软骨缺损的修复效果。

外翻张力固定预防和治疗小儿肱骨髁上骨折后肘内翻

目的探讨一种预防和治疗肱骨髁上骨折以及并发肘内翻的临床疗效。方法将纳入患者分为肱骨髁上骨折组(A组)及骨折后肘内翻畸形组(B组),采用自行设计的双克氏针交叉外翻张力固定方法治疗。术后随访并评价疗效。结果术后骨折及截骨均愈合良好,肘关节功能恢复满意,A组肘内翻12例,发生率为3.9%,总优良率为88.9%;B组肘内翻复发2例,复发率为3.2%,总优良率为94%。结论克氏针交叉外翻张力固定是预防和治疗小儿肱骨髁上骨折后肘内翻的良好固定方法。

前侧塑形钢板固定治疗儿童股骨转子部骨折

目的探索一种儿童股骨转子部骨折的新术式。方法选取年龄3～14岁、股骨转子部骨折患者,手术取前外侧入路暴露骨折部位,骨折复位后于转子部及股骨干上端前侧放置适当塑形后的T型钢板,由前向后用5～7枚螺钉加压固定,术后髋人字石膏固定患肢2个月。结果术后拍片示骨折复位及固定良好且螺钉未伤及骺板,随访所有11例患者术后骨折愈合及肢体功能恢复顺利。结论前侧塑形钢板固定是儿童股骨转子部骨折手术治疗的理想选择。

脊髓脊膜膨出胎鼠模型的建立及其机体抗氧化能力检测

目的:建立脊髓脊膜膨出(myelomeningocele,MMC)胎鼠模型并研究畸形机体抗氧化能力的改变。方法:取妊娠小鼠40只,随机分为3个实验组和1个对照组,分别于不同的时间点连续灌服全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)和同剂量大豆油,于孕18日剖宫取胎:①观察胎鼠外观畸形情况、椎板闭合情况、脊髓病理及神经细胞超微结构改变,②测定畸形胎鼠肝组织内超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)、总抗氧化能力(total antioxi-dant activity,T-AOA)及丙二醛(malonyl dialdehyde,MDA)含量。结果:实验组共获得MMC胎鼠93只,总畸形率达61.2%,各组MMC畸形率分别为T1-37.2%、T2-68.3%、T3-73.9%;各实验组GSH-Px、SOD、T-AOA均低于对照组(P<0.05),MDA含量均高于对照组(P<0.05)。结论:ATRA致畸是制作MMC胎鼠模型的简单有效的方法,MMC胎鼠抗氧化机能存在不同程度的降低。

转化生长因子β_3基因转染兔骨髓间充质干细胞的实验研究

目的构建转化生长因子β3（transforming growth factor β3，TGF-β3）的腺病毒载体，并通过腺病毒载体将TGF-β3基因转染骨髓间充质干细胞（marrow mesenchymal stem cells，MSCs），使其在细胞内得到表达。方法将人TGF-β3质粒定向克隆进入穿梭质粒pAdTrack—CMV中，与pAdEasy-1共同转入细菌并重组，获得TGF-β3重组腺病毒质粒，用脂质体法导入包装细胞HEK293中，48～96h后荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达。取1月龄新西兰大白兔5只，取其胫骨骨髓。采用密度梯度离心法分离纯化MSCs，并进行传代。取传至第3代细胞采用TGF-β3腺病毒载体转染，10h后荧光显微镜观察绿色荧光表达，转染TGF-β3重组腺病毒4d后的MSCs用免疫细胞化学方法观察TGF-β3在细胞内的表达。结果pAdEasy—TGF-β3转染HEK293细胞48～96h后，荧光显微镜可见明显的绿色荧光表达。兔骨髓分离培养10d后，培养MSCs融合达70％～80％、贴壁紧密，细胞形态均一，似成纤维细胞；14d完成原代细胞培养。TGF-β3重组腺病毒转染MSCs17h后，荧光显微镜下出现少量绿色荧光，48～72h荧光加强，荧光与MSCs轮廓一致。免疫细胞化学观察，转染TGF-β3重组腺病毒MSCs胞浆内有棕黄色阳性颗粒表达。结论TGF-β3基因重组腺病毒载体的成功构建并在MSCs内的表达，为创伤愈合的基因治疗提供了研究基础。

基因修饰BMSCs抑制增生性瘢痕的实验研究

目的通过将转染TGF-β3c2s2基因的兔BMSCs移植于兔耳瘢痕模型,观察转基因BMSCs对创面愈合后增生性瘢痕形成的影响。方法成年健康日本大耳白兔20只,体重1.7～2.5kg,雌雄不拘。取第3代兔BMSCs,经Ad-TGF-β3c2s2在感染复数150下转染,培养孵育24h后,调整细胞浓度为1×105/mL备用。将纯化、浓缩的Ad-TGF-β3c2s2颗粒,DMEM/F12(不含FBS)稀释为1×108pfu/mL备用。于20只日本大耳白兔双侧兔耳分别制备两个2cm×2cm大小的腹侧全层皮肤、软骨缺损创面。将每只兔的4个创面随机分为空白对照组(A组)、Ad-TGF-β3c2s2组(B组)、BMSCs组(C组)和BMSCs/Ad-TGF-β3c2s2组(D组),并以自身正常皮肤作为正常对照(E组)。将备好的细胞及病毒液分别按创面分组进行局部移植。于术后21、45、90d行大体观察、瘢痕硬度和厚度测定、HE染色和免疫组织化学检测。结果大体观察:A、B、C组上皮化后创面均逐渐形成不同程度的瘢痕,伤后45d瘢痕增生程度达高峰,明显高出皮肤表面,持续至90d,D组在观察期内均无明显高出周围皮肤的瘢痕形成。术后45d和90d,A、B、C组瘢痕厚度和硬度明显高于D组,且差异均有统计学意义(P<0.01),而B组低于A、C组,差异有统计学意义(P<0.01);D组愈合后创面厚度和硬度与正常皮肤接近。HE染色观察:A、C组伤后45d可见浅层组织结构排列紊乱,胶原纤维粗大,呈交错网织状排列;B组和D组结构与正常皮肤接近,但较E组胶原排列致密,表皮较A、C组薄;90d各组结构与45d相似。BrdU免疫组织化学观察,伤后21、45d,C、D组均能见到散在分布、胞核染色阳性的棕色细胞,A、B、E组均为阴性。结论创面局部移植人TGF-β3c2s2基因修饰的BMSCs,具有抑制创面愈合后增生性瘢痕的作用。

带锁髓内钉并骨折端小钢板治疗股骨干骨折不愈合和延迟愈合15例临床分析

目的探讨使用交锁髓内钉并骨折端局部小钢板治疗股骨不愈合和延迟愈合的临床疗效。方法对股骨骨折不愈合及延迟愈合患者15例均采用有限切口切开复位顺行扩髓,静力锁定,骨折端应用小钢板加植骨治疗。结果所有病例均获随访,时间为11～24个月(平均18个月),骨折均达到骨性愈合,愈合时间为7～23个月。结论交锁髓内钉加骨折端钢板固定并植骨治疗骨不愈合及延迟愈合具有固定牢靠,利于关节早期活动,促进骨愈合等优点,值得推荐使用。

外源性透明质酸钠对骨性关节炎患者的血清及关节滑液中基质金属蛋白酶-9的影响

骨性关节炎（osteoarthritis，OA）是一组以关节软骨退变为主要病理特征的临床综合征，其发病原因至今尚不清楚。软骨细胞赖以生存的细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的合成与降解失衡是导致软骨退变的重要原因之，许多研究表明基质金属蛋白酶家族（matrix metalloproteinases，MMPs）在这一过程中起重要作用.对于甲、中期的OA患者，

人脂肪干细胞的分离培养与鉴定

目的探索一种体外分离培养人脂肪干细胞(h ADSC)的有效方法。方法选择健康女性5例,年龄25~45岁;无任何其他系统性疾病。对其应用抽脂术获取人脂肪组织,并用Ⅰ型胶原酶进行消化,贴壁培养,传代扩增,绘制不同代数细胞增殖曲线,诱导hADSC向成骨、成脂细胞分化,确定其分化潜能,并分别用茜素红和油红O染色进行鉴定。结果原代hADSC第2天开始贴壁,形态呈纺锤型,类似纤维细胞,增殖较快,呈漩涡状排列。第3代至第5代hADSC生长曲线类似,都呈S形;成骨、成脂诱导2周后进行茜素红染色和油红O染色,结果都为阳性。结论通过对抽脂术获得的人脂肪组织进行分离培养,可以得到有效的hADSC,且具有向成骨、成脂细胞方向分化的能力,可作为进一步实验研究的种子细胞。

TGF-β 3c2s2基因转染骨髓间充质干细胞对创面愈合中转化生长因子β表达的影响及意义

目的：外伤后病理性瘢痕的形成与创面的愈合过程有着密切的联系。创伤愈合时期引入细胞因子或生长因子及其他影响因素。调节创伤愈合机制，即可能改变细胞外基质结构。达到预防瘢痕形成的目的。实验拟观察TGF-β3c2s2基因转染的骨髓间充质干细胞在创面修复与重塑过程中对转化生长因子β1和转化生长因子β3表达的影响。方法：实验于2005-10／2007-03年在重庆医科大学附属儿童医院外科实验室、动物实验中心完成。①实验材料：四五周龄日本大耳白兔2只，体质量300～400g，雌雄不限；健康成年日本大耳白兔20只。体质量1．7-2．5kg。雌雄不限，均由重庆医科大学动物实验中心提供，实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。②实验方法：选取四五周龄日本大耳白兔分离培养骨髓闻充质干细胞。选取健康成年日本大耳白兔20只，每只兔耳腹侧制作2个皮肤、软骨全层缺损创面共80个。创面以自身对照为前提随机分为4组。每组20个创面：实验组：加入Ad—TGF-β3c2s2转染的骨髓间充质干细胞：空白对照组：加入消毒的DMEM／F12（不含胎牛血清）：腺病毒组：加入Ad—TGF—β3c2s2腺病毒；骨髓间充质干细胞组：加入骨髓间充质干细胞。③实验评估：观察瘢痕形成情况。苏木精-伊红染色、免疫组织化学技术观察瘢痕组织的组织学形态和检测瘢痕组织中转化生长因子β1和转化生长因子β3表达和变化规律。结果：①实验组在整个过程中无明显高出周围皮肤的瘢痕形成。其他组上皮化后。创面均逐渐形成不同程度的瘢痕。伤后45d瘢痕增生程度达高峰。明显高出皮肤表面；持续至90d左右。②实验组和腺病毒组结构较接近正常皮肤，比正常皮肤胶原排列致密。略厚：空白对照组、骨髓间充质干细胞组伤后45d可见浅层组织结构排列紊乱。胶原纤维粗大呈交错网织状排列。③实验组伤后21，45,90d转化生长因子β1表达明显低于其他组和正常皮肤（P〈0．01）。其表达随时间逐渐下降，转化生长因子β3表达高于其他组和正常皮肤（P〈0．01）。各组转化生长因子β3的表达随时间逐渐下降。结论：TGF-β3c2s2基因转染的骨髓间充质干细胞移植于局部创面。对创面修复过程中转化生长因子β1和转化生长因子β3表达有显著影响。通过这种影响减轻创面修复后增生性瘢痕的形成。

中西医结合治疗儿童髋关节滑膜炎疗效观察

目的:观察中西医结合治疗儿童髋关节滑膜炎的临床疗效。方法:选取儿童髋关节滑膜炎患者21例,给予中医采用中药内服外敷,穿刺抽吸髋关节积液、改善微循环等处理,以及患肢皮牵引制动等。结果:21例患者出院后随访3个月,治愈19例,好转2例,治愈率为90.48%。结论:中西医结合治疗儿童髋关节滑膜炎疗效满意。

经皮撬拨复位穿针固定治疗小儿桡骨颈骨折25例

笔者自2009年5月至2011年6月,采用经皮克氏针撬拨复位法治疗桡骨颈骨折25例,获得满意的效果,现总结如下。1资料与方法1.1纳入标准（1）年龄4-12岁,前臂X线或MR检查明确诊断单纯桡骨颈闭合性骨折,同意接受闭式穿针夹治疗;

平乐正骨1号方熏洗对儿童肱骨髁上骨折术后肘关节功能的影响

目的:评价平乐正骨1号方熏洗对儿童肱骨髁上骨折术后肘关节功能的影响。方法:选择肱骨髁上骨折切开复位内固定术后患者64例,分为对照组和观察组。2组患者均采用术后基础治疗。对照组采用术后基础治疗及指导功能锻炼;观察组在此基础上配合平乐正骨1号方熏洗。疗程均为4周。结果:观察组在术后熏洗2个疗程后关节功能评分明显好于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:平乐正骨1号方熏洗对儿童肱骨髁上骨折术后肘关节功能恢复疗效显著。

中药有效成分及单体干预脂肪干细胞向骨细胞诱导分化研究进展

脂肪来源干细胞(adipose derived stem cells,ADSCs)具有多个方向的分化潜能,逐渐成为干细胞领域的研究热点。众学者在特定的诱导条件下对各种中药有效成分干预脂肪来源干细胞向骨细胞分化的影响进行了探索,并取得一些进展。目前研究使用的诱导剂多为激素和细胞因子之类。中医药在治疗骨折方面具有较多的临床经验,疗效好且安全性高。然而目前关于中药在干预脂肪来源干细胞向骨细胞诱导分化方面的研究较少,对其进行总结,以供参考。

关节软骨组织工程研究进展

关节软骨损伤是临床多发病,由于软骨的自身修复能力非常有限,目前的治疗方法均不能实现软骨的生物修复,缺损软骨的修复问题成为临床上较为棘手的问题之一。组织工程学的发展为解决这个问题提供了新思路,使缺损软骨的完全再生成为可能。

PACS和Photoshop辅助下等腰三角形截骨并克氏针张力扣固定治疗儿童肘内翻

目的:应用影像归档和通信系统(picture archiving and communication system,PACS)和Photoshop系统辅助等腰三角形截骨并克氏针张力扣固定治疗儿童肘内翻的疗效分析。方法:回顾性分析自2014年10月至2019年10月采用肱骨远端等腰三角形截骨并克氏针张力扣固定治疗儿童肘内翻20例的临床资料,男13例,女7例;年龄3.2~13.5岁,中位数6.65岁;左侧12例,右侧8例。均为肱骨远端骨折畸形愈合后的远期并发症。术前用PACS系统设计截骨,模拟测量顶角位置及底边长度。再将图片导入Photoshop系统,画出术后模拟效果图,指导模拟截骨。结果:20例患儿均获得随访,时间20~24个月,中位数22.5个月。最后一次复查时患肢提携角5°~13°,中位数8.3°。疗效根据Flynn肘关节功能评分标准评价:优16例,良2例,可2例。结论:PACS和Photoshop系统辅助下等腰三角形截骨并克氏针张力扣固定治疗儿童肘内翻取得良好的临床疗效。

仙方活命饮加味内服外敷治疗儿童髋关节滑膜炎临床观察

目的:观察仙方活命饮加味内服外敷治疗儿童髋关节滑膜炎的临床疗效。方法:将80例儿童髋关节滑膜炎患者随机分为治疗组和对照组,每组40例。对照组给予常规卧床休息及患肢皮肤牵引治疗,治疗组在对照组治疗的基础上加用仙方活命饮内服外敷。观察两组治疗7 d、14 d时疗效并进行分析。结果:治疗组治愈30例,好转9例,未愈1例,总有效率为97.50%;对照组治愈28例,好转8例,未愈1例,总有效率为90.00%。两组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。两组临床观察指标评分均有改善(P<0.05),且治疗组优于对照组(P<0.05)。结论:髋关节滑膜炎采取仙方活命饮加味内服外敷综合治疗行之有效,可以缩短治疗时间,减少疼痛等。