逆转录病毒感染法对RP患者人体细胞向iPS细胞和iPS—RPE细胞诱导分化的研究

背景视网膜色素上皮（RPE）细胞移植是目前人类尝试治疗视网膜色素变性（RP）的主要手段。诱导多能干细胞（iPSCs）将成为移植细胞的一个重要来源，人胚胎干细胞（hESCs）可以无限期地自我更新和分化，是RPE细胞移植的重要供体来源。此外，iPS-RPE细胞为患者自身细胞成为治疗源组织提供了个性化治疗平台。目的评估利用逆转录病毒将Oct4、Sox2、c—Myc和K归4种基因导入RP患者皮肤成纤维细胞后诱导入iPSCs的可行性，并建立将正常人iPSCs诱导分化为RPE细胞的方法。方法分别采集基因突变点为SNRNP200p．S1087L的RP患者及无SNRNP200p．S1087L突变受试者的大腿皮肤组织块约2cm-3cm。采用胰蛋白酶消化和组织块培养法分离纯化得到成纤维细胞并进行传代，取第3代细胞用于研究，分别采用形态学和免疫荧光技术对培养细胞进行鉴定。采用含OCT4、SOX2、C—MYC和KLF44种cDNA的质粒病毒转染的成纤维细胞，并用hESCs条件培养液诱导iPSCs，采用细胞形态学、碱性磷酸酶（AP）染色、干细胞表面多潜能标志物表达对所得到的iPSCs和iPS—RPE细胞进行鉴定，并通过细胞在SCID小鼠的体内种植考察iPSCs的成瘤性。采用诱导分化拟胚体（EB）法将不含SNRNP200p．S1087L突变的iPSCs诱导分化为RPE细胞，分别采用免疫荧光技术和实时荧光定量PCR法检测细胞中特异性蛋白的表达。结果用皮肤组织块培养的成纤维细胞呈梭形和多角形，光学显微镜下可见细胞间排列紧密，细胞形态和大小趋于一致，细胞中特异性蛋白Vimentin表达阳性。经逆病毒转染的成纤维细胞培养后第5～7天可见小的细胞聚集，细胞形态由梭形变为圆形；培养后20d出现类似hESCs集落形态的iPSCs克隆；培养后25～30d细胞中的标志物SSEA3、SSEA4、TRA—1-60、TRA-1-81及Nanog均呈阳性表达，培养后12周形成的iPSCs克隆中AP染色阳性，接种到SCID小鼠体内后形成畸胎瘤。免疫荧光染色显示，诱导分化后30d时iPS—RPE细胞中RPE细胞特异性标志物RPE65、闭锁小带蛋白1（ZO-1）和卵磷脂视黄醇酰基转移酶（LRAT）蛋白均呈阳性表达。结论利用逆转录病毒将Oct4、Sox2、c-Myc和Kif44种基因转入SNRNP200p.S1087L突变的RP患者皮肤成纤维细胞后可以获得iPSCs，建立的iPSCs有ESCs的形态和多能分化的特征。采用同样的转染技术可在无SNRNP200p．S1087L突变的人皮肤成纤维细胞中建立体外高分化、高效能的iPS-RPE细胞。

雷帕霉素对ARPE19细胞分化的调控作用

背景视网膜色素上皮（RPE）细胞移植是多种遗传性视网膜变性疾病治疗的研究方向，但体外培养的RPE细胞系都存在细胞的去分化问题，而研究表明哺乳动物类雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路的异常激活会导致RPE细胞的去分化状态。因此抑制mTOR信号通路应有助于抑制RPE细胞的去分化状态。目的观察雷帕霉素是否能够抑制mTOR信号通路，调控人RPE细胞系ARPE19细胞的分化。方法将ARPE19细胞接种于12孔板进行培养并分为对照组和雷帕霉素组，分别在培养基中添加DMSO和终浓度400nmol／L的雷帕霉素，分别于细胞培养后24h和48h收集各组细胞，通过免疫荧光法检测各组细胞中闭锁小带1（ZO-1）蛋白的表达，分别采用实时荧光定量PCR和Western blot法检测各组细胞中RPE特异性基因和蛋白的相对表达量。结果免疫荧光检测结果显示，雷帕霉素组细胞培养后24h和48h，细胞中ZO-1表达的荧光强度均明显增强。实时荧光定量PCR结果显示，雷帕霉素组ARPE19细胞处理后24h，RPE细胞特异性基因RPE65、MERKT和LRAT mRNA相对表达量较对照组分别提高了25．97％、29．71％和13．00％，差异均有统计学意义（P=0．04、0．04、0．04）；雷帕霉素组细胞处理后48h，RPE65、LRAT、rLBP1、BEST1、keratin18和MERKT mRNA的相对表达量较对照组分别提高了174．00％、88．00％、56．18％、193．81％、10．83％和35．02％，差异均有统计学意义（P=0．00、0．04、0．U1、0．04、0．04、0．03）。Western blot检测结果显示，雷帕霉素组细胞处理后24h和48h，细胞中Akt／mTOR信号通路相关蛋白p-mTOR、p-P70S6和p—S6表达条带均较对照组均明显减弱；雷帕霉素处理细胞后24h，细胞中RPE特异性蛋白ZO-1蛋白的相对表达量提高40％，差异有统计学意义（P=0．01）；雷帕霉素处理细胞后48h，ZO-1、MERKT、Catenin和LRAT蛋白的相对表达量较对照组分别提高36．00％、57．37％、13．68％和41．07％，差异均有统计学意义（P=0．Ol、0．00、0．04、0．04）。结论雷帕霉素可以抑制mTOR信号转导通路的激活，上调ARPE19细胞中RPE特异性基因的表达；抑制mTOR信号转导通路后体外培养的RPE细胞系更接近于活体RPE细胞。

目标区域捕获测序检测到一视网膜色素变性家系ABCA4基因新突变

目的研究我国一个常染色体隐性遗传的视网膜色素变性（RP）家系患者的临床表型及致病基因突变，并分析表型与基因型间的关系。方法实验研究。收集了宁夏人民医院眼科诊治的一个RP家系的临床资料，共有7名家庭成员参与研究，其中包括2名患者和5名正常成员。完善家系内所有参与成员的眼科检查，包括最佳矫正视力（BCVA）、视野、眼底照相、光学相干断层扫描（OCT）及全视野视网膜电流图（ERG）等。针对180个已知的遗传性视网膜疾病致病基因及9个高度可疑的候选基因设计目标区域捕获芯片，利用该捕获芯片对先证者（Ⅳ-4）进行目标区域内的高通量二代测序，借助优化的生物信息学分析对捕获的遗传变异进行筛查过滤，最终通过家系内共分离验证确认致病突变，进一步分析该突变与患者表型间的关系。结果临床检查结果表明该家系内的2名患者的临床表现均符合典型的RP改变，遗传学分析结果证实了ABCA4基因c．419G〉A突变是该家系的致病突变。该突变导致了ABCA4基因所编码的蛋白第140号氨基酸由精氨酸变为谷氨酰胺（p．Arg140Gln），保守性分析显示该突变位点在各物种中高度保守，PloyPhen-2软件预测结果表明该突变具有较高的致病性。结论本研究借助基于高通量二代测序平台的目标区域捕获测序，首次发现了ABCA4基因新突变p．Argl40Gln是一个常染色体隐性遗传RP家系的致病突变，进一步扩充了ABCA4基因的遗传突变谱及表型谱。

人皮肤成纤维细胞的分离和原代培养

目的采用实时细胞监测技术(RTCA)观察人皮肤成纤维细胞增殖过程。方法采集5例患者的皮肤组织,经胰酶消化和传代,对分离纯化后的成纤维细胞使用RTCA动态检测其增殖过程,并进行免疫荧光检测特异性蛋白表达。结果 RTCA的实验数据比较真实地接近细胞实际的生长情况;免疫荧光结果显示分离的成纤维细胞能够表达波形蛋白。结论 RTCA动态检测能为细胞移植提供有力的保障。

卷曲蛋白4基因新致病突变p.E160K引起家族性渗出性玻璃体视网膜病变

目的 研究1个常染色体显性遗传家族性渗出性玻璃体视网膜病变（FEVR）家系的致病基因突变.方法 一个3代常染色体显性遗传FEVR家系中3例患者及1例患者的配偶纳入研究.先证者,男,5岁.其母亲和外公眼底均表现为典型的FEVR改变;父亲眼底检查正常.采集所有受试者外周静脉血,提取基因组DNA,扩增候选致病基因Norrie病、卷曲蛋白4（FZD4）、低密度脂蛋白受体相关蛋白5、四旋蛋白12、锌指蛋白408基因的全部编码区及外显子-内含子交界区剪切位点附近的序列,直接测序法检测潜在致病基因突变.应用分析软件明确该基因突变位点的保守性、有害性及可能引起的蛋白结构改变.结果 3例患者及先证者父亲共检测到5个单核苷酸变异,滤过最小等位基因频率值高于0.001的高频变异位点4个,可疑致病突变位点1个即FZD4基因c.478G＞A.该突变位点所对应的氨基酸改变为FZD4基因所编码蛋白的第160号氨基酸从谷氨酸突变为赖氨酸（p.E160K）.基因型和表型共分离验证结果表明,FZD4 p.E160K为该家系的致病突变位点.蛋白序列同源性分析结果显示,该突变位点在多个物种中均高度保守;功能性分析结果显示,该突变为有害性突变;晶体结构分析结果显示,该突变能够引起第160号氨基酸位点与第152号天冬酰胺间的氢键消失,影响蛋白的三级结构和正常功能.结论 发现并证实了该家系FZD4 p.E160K为FEVR的新突变位点.

mTOR信号通路在iPS定向分化RPE细胞中的调控机制研究

目的探讨mTOR信号通路在iPS定向分化RPE细胞中的调控机制。方法培养iPS细胞,悬浮培养后形成拟胚体EB,诱导分化为RPE细胞。通过免疫细胞化学的方法,观察iPS-RPE细胞分化一个月后特异性蛋白(RPE65、LRAT、zo-1)的表达。同时通过Q-PCR,Western Blotting的方法检测iPS-RPE在不同分化时间点(分化1个月、2个月、3个月)上,iPS-RPE细胞中特异性基因、蛋白的表达变化以及mTOR信号通路的活性。最后应用雷帕霉素抑制iPS-RPE细胞中mTOR的通路,进一步观察iPS-RPE细胞中的蛋白表达变化。Q-PCR采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)进行组间比较。结果荧光显微镜观察到iPS-RPE细胞在分化1个月时,表达RPE65、LRAT、zo-1蛋白。与对照组iPS比较,Q-PCR结果显示,实验组RPE65在分化1个月,2个月,3个月时的表达量分别为0.84±0.13,4.8±1.1,20.3±4.9(P=0.000);Best1分化1个月,2个月,3个月时的表达量分别为1.5±0.16,2.3±0.68,11.78±1.57(P=0.000);MerTK在分化1个月,2个月,3个月时的表达量分别为4.12±1.94,1.87±0.76,15.53±1.33(P=0.000),CK18分化1个月,2个月,3个月时的表达量分别为2.4±0.63,2.3±0.37,9.67±1.44(P=0.000),Western Blotting结果也表明,随着分化时间延长,iPS-RPE细胞中特异性蛋白(BEST1、catenin、MerTK)表达量有显著提高,而mTOR信号通路的活性受到抑制。与对照组(加DMSO)比较,雷帕霉素处理获得的iPS-RPE细胞中BEST1、MerTK、ck18蛋白表达量上升不是很明显,catenin蛋白显著提高。结论建立了体外高等分化、功能高效的iPS-RPE细胞,随iPS-RPE细胞分化时间延长,mTOR信号通路的活性是逐步抑制的。