猪流行性腹泻病毒SHpd/2012株Nsp8基因分析及真核表达

应用生物信息工具和分子克隆技术对PEDV SHpd/2012株Nsp8基因编码的蛋白进行了结构和功能分析以及体外表达。结果显示,NSP8蛋白是一个含有194个氨基酸的亲水性蛋白,不含信号肽和跨膜区。SHpd/2012毒株高度保守的NSP8氨基酸序列与CV777、AJ1102等毒株同源性高。NSP8蛋白也是一个单体蛋白,共有5个优势抗原表位。此外,本研究成功地在293T细胞内表达了NSP8蛋白,为进一步研究猪流行性腹泻病毒NSP8蛋白的功能提供了理论基础。

美国能源部国家实验室未来十年战略要点启示

为了提高我国国家（重点）实验室的创新能力建设和发展管理水平,本文通过分析解读美国能源部国家实验室2012～ 2021十年发展规划内容,发现美国能源部国家实验室具有依托大学建设,配置有大科学装置,人员数量庞大、人员构成多样、并向本科生开放,年度运行经费数量稳定且使用率极高等鲜明特征.在未来十年中,其仍将服务美国国家战略放在首要位置,瞄准未来趋势聚焦核心能力,将大科学装置和先进仪器建设维护作为核心竞争力之一,并制定了详细的设备和基础设施投资计划,为科学研究提供了稳定可预期的环境.论文据此对我国国家（重点）实验室发展提出了五条建议.

猪小肠上皮细胞酵母双杂交cDNA文库的构建

猪小肠上皮细胞(intestinal epithelial cell,IECs)是猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)在宿主体内感染的靶细胞,为了研究PEDV在体内与宿主细胞蛋白之间的互作关系以便于揭示其致病机理,本研究以IECs为研究对象,提取了IECs的总RNA,利用SMART技术经过反转录、扩增和纯化获得双链cDNAs后,将其与pGADT7-Rec和carrier DNA共同转化至酵母Y187菌株,进行选择性培养基(SD/-Leu)筛选以及文库容量及质量的鉴定。结果显示,本研究构建的IECs-cDNA文库其库容量为1.3×10~8 pfu/mL,插入cDNA片段长度为250～2500 bp,文库阳性率达100%。本研究结果表明构建的IECs-cDNA文库具有较好的多态性,为后续研究PEDV与宿主细胞蛋白之间的互作关系提供了有力支持。

猪流行性腹泻病毒SHpd/2012株S蛋白的表达鉴定

猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的一种可致仔猪严重腹泻的高度接触性肠道传染病。S蛋白在病毒感染和入侵宿主细胞的过程中具有重要作用。为了研究S蛋白的特点,本研究扩增了PEDV新流行毒株SHpd/2012的纤突蛋白S基因分段片段S11、S12、S13、S21和S22,将得到的目的片段导入原核表达载体pGEX-6P-1中,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中进行表达、鉴定,获得了正确的PEDV S的分段蛋白S11(24-277aa)、S12(272-571aa)、S13(560-797aa)、S21(793-1109aa)及S22(1102-1384aa),为后续单克隆抗体的制备和致病机制的研究奠定了基础。

我国高校基础研究发展探析

基础研究在我国高校中的定位经过了一个不断发展提升的历程。从产出规模看,高校在我国基础研究中的主力军位置不断得到巩固,不同层次高校对论文产出的贡献存在差异;高校基础研究产出的影响力变化表现为明显的阶段性特征,但与国际平均水平还有一定差距。缺乏重大原创性成果和科技领军人才,科研管理体制和评价机制改革滞后是我国高校制约基础研究发展的主要问题。

猪流行性腹泻病毒SHpd/2012株侵染Vero细胞特性分析

为了探究PEDV(猪流行性腹泻病毒)流行毒株SHpd/2012侵染细胞的特性,研究采用IFA(间接免疫荧光)及绘制病毒一步生长曲线等方法,对感染PEDVSHpd/2012株后的Vero细胞(非洲绿猴肾细胞)病变过程进行研究。结果发现,CPE(细胞病变)主要表现为细胞肿胀、变圆、皱缩、聚集成合胞体甚至从培养瓶壁大量脱落。IFA结果显示,接毒后12h病毒开始增殖,在接毒后36h时感染细胞数量最多,其后病毒增殖速度逐步下降,60h时趋于平稳。病毒一步生长曲线结果显示,SHpd/2012株感染细胞后24~60h的毒价一直处于较高水平,60h后开始下降。此外,本研究成功克隆并真核表达了PEDV S蛋白,为研究PEDV与受体蛋白的互作及病毒的致病机制奠定基础。

猪流行性腹泻病毒Nsp8与宿主细胞互作蛋白的筛选及鉴定

猪流行性腹泻病毒Nsp8是RNA依赖的RNA聚合酶辅助因子,在病毒基因组复制中具有重要作用。为了从宿主细胞蛋白角度了解PEDV Nsp8蛋白的作用,本研究以PEDV感染的宿主细胞LLC-PK1为研究对象,提取LLC-PK1细胞总RNA,利用SMART技术经过反转录、扩增和纯化获得双链cDNAs,将其与pGADT7-Rec和carrier DNA共同转化至酵母Y187菌株,构建LLC-PK1 cDNA酵母文库,对该文库容量及质量进行鉴定。结果显示:本研究构建的LLC-PK1 cDNA文库库容量为2.1×10^7 CFU/mL,插入cDNA片段长度为500~2500 bp;将构建的诱饵质粒pGBKT7-Nsp8与LLC-PK1 cDNA酵母表达文库进行杂交,筛选阳性克隆菌株并测序分析,共获得了8个潜在互作蛋白;将8个蛋白分别与诱饵质粒pGBKT7-Nsp8进行酵母回复杂交验证,有4种宿主蛋白与Nsp8蛋白共转化后能在含X-α-Gal的DDO/X/A和QDO/X/A选择培养基中形成蓝色菌落;选择其中出现频率最高的LDHB蛋白与Nsp8,分别构建含有Flag标签和HA标签的真核表达载体,利用不同的标签抗体进行Co-IP鉴定,发现Nsp8与LDHB蛋白可以发生免疫共沉淀;通过激光共聚焦显微镜观察发现,Nsp8和LDHB蛋白在细胞质中存在明显共定位。本研究结果表明,Nsp8与宿主蛋白LDHB存在相互作用,推测LDHB蛋白可能通过与PEDV Nsp8蛋白在细胞质中的相互作用参与病毒复制的生物学过程。

猪流行性腹泻病毒流行株感染小型猪的组织病理学观察

为了探究猪流性腹泻病毒(PEDV)感染对小型猪组织脏器的影响,将PEDV流行株SHpd/2012经口服感染5日龄小型猪,待其出现明显临床症状且濒临死亡时剖杀,并采集小肠、肠系膜淋巴结、脾、肾、肝等组织脏器制作病理切片进行显微观察,同时利用抗PEDV特异性单抗对各组织进行免疫组织化学观察。结果显示:小型猪在攻毒后24 h即出现猪流行性腹泻的典型临床症状,猪只表现出明显的水样腹泻,同时伴随有呕吐、脱水等症状,甚至出现身体衰竭。解剖观察攻毒组小型猪内脏,可见肠腔内充满黄白色内容物和气体,肠壁变薄,呈半透明状;肠系膜淋巴结显著肿大,其他组织脏器未发现肉眼可见的病理变化。组织病理学观察显示攻毒组小型猪小肠组织病变最为严重,主要表现为小肠绒毛脱落、崩解、萎缩。此外,肠系膜淋巴结出血、有大量炎性细胞浸润;脾脏有大量炎性细胞浸润,脾小梁溶解消失,红髓白髓界限不清;肾脏肾小球变性坏死,肾单位结构崩解,模糊不清。免疫组化分析结果显示,攻毒组试验猪的小肠组织中可检测到大量病毒感染的细胞,而在肺脏、肝脏、肾脏、脾脏等组织中均未检测到PEDV分布。这一结果表明SHpd/2012株与经典毒株相比病变范围有所扩大,为深入研究PEDV致病机制积累了科学数据。

猪流行性腹泻病毒感染Vero细胞的细胞病理学研究

对感染猪流行性腹泻病毒(PEDV)的Vero细胞进行透射电镜观察发现:在病毒感染初期(6h),尽管细胞结构完整,部分细胞线粒体、粗面内质网扩张,胞浆出现空泡;随着感染时间的增长(12h),病毒粒子逐渐增多,细胞质内出现较多空泡状结构,病毒粒子先后出现在胞浆及细胞核内部;感染24h后,病毒粒子数目显著增多,空泡化明显,出现细胞核分解,细胞融合更加明显;感染最后阶段(48h),空泡化严重,核质固缩,细胞间大量融合,病毒粒子出芽排出。以上结果,为揭示猪流行性腹泻病毒的感染与致病机制积累了数据。

猪流行性腹泻病毒SHpd/2012株S1和S2基因片段的真核表达

为探究猪流行性腹泻病毒(PEDV)的新毒株SHpd/2012在感染细胞时与细胞的相互作用机制,根据已得到的序列设计引物,克隆了S1和S2基因片段,构建了pCAGGS-S1和pCAGGS-S2真核表达质粒。间接免疫荧光和Western-blot实验表明,转染后S1和S2都能在Vero细胞内表达,且转染48h后的表达量较高;其中S1蛋白分子量约为90kDa,S2蛋白分子量约为60kDa。流行毒株SHpd/2012的S1与S2两肽段的成功表达,为之后进一步研究PEDV与Vero细胞的相互作用奠定了基础。

日记是什么

妈妈说,写写日记吧,可以提高你的写作水平.老师说,写写日记吧,可以抒发你的心情.……

猪流行性腹泻病毒流行毒株的分离与鉴定

2016年3月江苏某猪场发生了哺乳仔猪腹泻疫情,导致大部分哺乳仔猪严重腹泻和死亡。为确定此次腹泻的病原,从该猪场采集了6份仔猪腹泻样品,利用RT-PCR方法对可引起仔猪腹泻的猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪轮状病毒(PoRV)三种主要腹泻病毒进行了检测。结果显示,6份样品均呈现PEDV阳性,而TGEV和PoRV为阴性。无菌处理6份阳性样品后分别接种于Vero细胞,进行病毒分离培养;结果,6份样品中仅JSqd3/2016接种后可产生明显细胞病变,且连续传至第5代时细胞病变仍稳定存在。对JSqd3/2016分离株利用针对PEDV S蛋白的特异单抗进行间接免疫荧光鉴定结果显示,PEDV S蛋白单抗能够特异性识别JSqd3/2016分离株感染的Vero细胞。对JSqd3/2016-F5分离株S基因和ORF3基因进行克隆测序和序列比较分析结果显示,分离获得的JSqd3/2016毒株与目前的流行毒株亲缘关系较近,与经典毒株相比S基因存在较大变异,氨基酸同源性为93.0%~93.3%。本研究结果证实,PEDV变异毒株感染是该猪场仔猪腹泻疫情的主要病因。