红曲霉T-DNA插入转化库中桔霉素突变子的筛选

以农杆菌介导法建立的红曲霉T—DNA转化库为实验材料，采用抑菌圈法从5，000多个转化子中筛选出200株桔霉素突变子的候选菌株，用高效液相色谱法进一步筛选得到53株与出发菌株相比产桔霉素能力发生显著变化的突变子，其红曲中桔霉素含量介于0．04～154．57μg／g之间。进一步分析了突变子的红曲色价，发现突变子产桔霉素能力与产色素能力之间有一定的相关性。这些研究结果为进一步从分子水平上探讨红曲霉产桔霉素和色素等次生代谢产物之间的关系提供了材料和基础。

农杆菌介导的红曲菌T-DNA插入突变库的构建及色素突变子的性质分析

以农杆菌EHA105为介导,将带有潮霉素抗性基因和gus基因的T-DNA片段转化到红色红曲菌(Monascusruber)中。通过转化条件的优化,成功构建了含有5132个转化子的T-DNA插入突变库。根据菌落颜色与色素分泌情况筛选到50株色素突变子,聚合酶链式反应(PCR)表明上述突变子均有T-DNA片段插入。经5代的继代培养后,94%的突变子具有稳定性(潮霉素抗性)。对突变子产色素和桔霉素能力的分析表明其分泌次生代谢产物的能力发生了较大变化。本方法的建立,为进一步深入研究红曲菌的代谢调节和基因功能奠定了基础。

TAIL-PCR法快速分离红曲霉色素突变株T-DNA插入位点侧翼序列

采用热不对称交错PCR(thermal asymmetric interlaced PCR,TAIL-PCR)法分离红曲霉色素突变株T-DNA插入位点的侧翼序列,扩增到了长度介于500bp～1300bp之间的7个DNA片段,对这些DNA片段测序,并采用生物信息学方法对测序结果进行了分析,表明其中有1个片段与烟曲霉Af293发育调控子flbA的相似性较高。TAIL-PCR法成功应用于分离红曲霉突变株T-DNA插入位点的侧翼序列,为大规模获取插入位点侧翼序列建立了可行的方法,也为进一步研究红曲霉功能基因奠定了基础。

浓缩山西老陈醋对高脂血症小鼠血脂及血糖的调节作用

研究山西老陈醋和食醋浓缩物对高脂血症小鼠血脂和血糖的调节功能,评价食醋浓缩物取代山西老陈醋发挥保健功能的可行性。利用高脂饲料建立小鼠高血脂模型,模型鼠每天灌胃高、低剂量山西老陈醋(4、1 mL/(kg·bw·d))和食醋浓缩物(16、4 mL/(kg·bw·d)),进行小鼠体重、附睾脂肪质量、血清总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白的对比分析,评估其降血脂的功效;进行口服葡萄糖耐量试验,检测小鼠调节血糖的能力。结果表明:山西老陈醋和食醋浓缩物均降低高血脂小鼠的体重、附睾脂肪质量及脂肪系数,改善小鼠血清总胆固醇、甘油三酯和高密度脂蛋白指标,且食醋浓缩物的效果要优于山西老陈醋。同时,食醋浓缩物能显著降低高血脂小鼠的空腹血糖和餐后2 h血糖,而山西老陈醋对此效果并不明显,说明食醋浓缩物具有优于山西老陈醋的调节高脂血症小鼠血脂和血糖的能力。

酶解豆浆制酸豆奶的研究

本实验研究了在不同条件下用三种酶酶解豆浆中蛋白的程度。结果表明,酶B为酶解蛋白最充分的酶,其最佳酶解条件为:55℃,0.1mg/ml(豆浆中酶的浓度),水解4h。在该条件下制得豆浆酶解液,研究了酶解液与鲜牛奶混合比例、蔗糖的添加量、保加利亚乳杆菌:嗜热链球菌接种比例、前发酵时间等因素对酸豆奶感官质量的影响。所得酸豆奶经感观评定,结合经济因素,确定当酶解液与牛奶以1:1混合,两个菌种发酵剂按1:1的比例接种,接种量4%,蔗糖8%,香草香精0.04%,前发酵3h时,得到的酸豆奶感官口味最好,综合评价最高且最有应用前景。

血管钠肽(VNP)在大肠杆菌中的表达、纯化及活性分析

利钠肽家族成员在维持机体心血管平衡等方面发挥着重要的生理作用。人工设计的新型利钠肽分子血管钠肽(VNP)由C-型利钠肽和A-型利钠肽的功能结构域嵌合组成,具备两种利钠肽分子的优势功能。采用分子生物学方法,构建了BL21(DE3)/pGEX-4T-1-VNP原核表达系统,在大肠杆菌中实现了融合蛋白GST-VNP的可溶性表达。经离心、超声波破碎、GST亲和层析、G25凝胶过滤和肠激酶酶切后超滤离心便可获得电泳纯的目的产物VNP,最终每升发酵液可获得20 mg重组VNP蛋白。大鼠离体血管环张力法和去膀胱尿液收集法活性评价显示,VNP具有扩张血管和利尿双重功效。

融合蛋白Somatostatin-HSA不同串联体形式的表达及活性分析

目的:构建人生长抑素(somatostatin,SST)不同串联体形式与人血清白蛋白(HSA)的融合蛋白,比较其在毕氏酵母中的表达情况以及生物活性高低。方法:PCR法扩增获得SST14和SST28的二联体和三联体基因,酶切连接形成与HSA的融和基因,并克隆到酵母表达载体pPIC9K中,电击转化毕氏酵母GS115进行高效表达。结果:4种融和蛋白在毕氏酵母中表达水平各不相同,其中(SST28)2-HSA的表达量最高,为200mg/L;(SST14)3-HSA的表达量最低,仅50mg/L;(SST14)2-HSA和(SST28)3-HSA产量居中。药效学分析发现与天然SST-14标准品相比,(SST14)2-HSA药效最佳且具有长效性。结论:融合蛋白(SST14)2-HSA有望弥补SST单体自身半衰期过短的不足,打开SST长效药物发展的新篇章。

人脑钠肽与人血清白蛋白融合蛋白在毕赤酵母中的分泌表达及其活性

目的在毕赤酵母中表达重组人脑钠肽(BNP)与人血清白蛋白(HSA)融合蛋白,并检测其活性。方法重叠PCR法拼接BNP二联体与HSA基因,插入表达载体pPIC9K,电穿孔法转化毕赤酵母GS115,甲醇诱导表达,并对表达产物进行SDS-PAGE分析、Western blot鉴定及活性检测。结果融合基因(BNP)2-HSA经测序正确,重组表达质粒经双酶切鉴定构建正确。诱导72h,融合蛋白表达量最高,可达200mg/ml,且具有良好的反应原性,其活性为rhBNP标准品的1%。结论已在毕赤酵母中成功表达了具有一定生物活性的(BNP)2-HSA融合蛋白,为开发BNP长效药物奠定了基础。

人脑钠肽融合蛋白(HSA-(BNP)_2)在毕赤酵母中的发酵条件及纯化研究

对毕赤酵母工程菌GS115/pPIC9K-HSA-(BNP)2的发酵条件进行了优化,并对表达产物HSA-(BNP)2融合蛋白的纯化工艺进行了摸索。研究表明,菌体生长28h时菌浓较高,可进行诱导;同时,在2%甲醇浓度、培养液浓缩1.5倍、诱导表达72h时融合蛋白产量可达185mg/L。发酵液超滤浓缩后经Q Sepharose强阴离子交换层析和Superdex75凝胶过滤层析,获得的融合蛋白纯度为93%,Western blot分析其既具有BNP免疫原性又具有HSA免疫原性。毕赤酵母工程菌GS115/pPIC9K-HSA-(BNP)2经发酵优化后能高效表达HSA-(BNP)2融合蛋白,经两步层析获得的融合蛋白满足后期药效学与药代动力学实验的要求,为后续研究奠定了基础。

利用双抗生素标记提高血管钠肽在毕赤酵母中的分泌表达

依照血管钠肽氨基酸序列,根据毕赤酵母密码子偏爱性,人工合成了血管钠肽的编码基因,通过PCR技术,扩增出5'端含有组氨酸标签的血管钠肽基因片段,构建的分泌型表达质粒pPIC9K-VNP,pPICZαB-VNP分别经SalⅠ和SacⅠ线性化后,双质粒转化毕赤酵母GS115宿主菌后,G418/Zeocin双抗筛选出整合型His+Muts表达菌株,Tricine-SDS-PAGE和Western blot分析,证明His-VNP在毕赤酵母中可有效分泌表达,摇瓶产量可达70mg/L左右,双质粒整合较单质粒整合重组子目的多肽表达量提高了75%。生物学活性研究表明,表达产物在体外具有对巨噬细胞iNOS和TNFαmRNA的抑制作用。

共表达蛋白二硫键异构酶对IFNβ-HSA融合蛋白在毕赤酵母中表达的影响

目的探讨共表达蛋白二硫键异构酶(PDI)对干扰素β与人血清白蛋白(IFNβ-HSA)融合蛋白在毕赤酵母中表达的影响。方法根据GenBank公布的毕赤酵母PDI序列设计引物,利用PCR方法从毕赤酵母基因组中扩增目的基因片段,插入表达载体pPICZαA,并整合入融合蛋白(IFNβ-HSA)基因工程菌中,筛选共表达PDI的重组酵母菌,甲醇诱导表达,SDS-PAGE鉴定表达产物,ELISA法检测IFNβ-HSA的表达量。结果经PCR鉴定,重组表达质粒pPICZαA-PDI已转入毕赤酵母KM71/pPIC9K-IFNβ-HSA中。经SDS-PAGE分析,PDI在菌体内大量表达,原始菌株和共表达菌株均明显表达融合蛋白IFNβ-HSA,共表达PDI菌株表达量提高了60%,ELISA法测定达(22.49±3.52)mg/L。结论共表达PDI能促进外源蛋白的分泌表达,为进一步研究在毕赤酵母中过量表达分子伴侣对其分泌外源蛋白的影响奠定了基础。

人β干扰素与人血清白蛋白融合蛋白的表达及纯化

为开展人β干扰素-人血清白蛋白融合蛋白(IFNβ-HAS)的临床前研究,本研究采用免疫学方法对毕赤酵母转化子进行筛选,得到高产菌株8株。在5L发酵罐上对高产菌株进行诱导表达,产量达500mg/L。发酵液经超滤浓缩、染料亲和层析、镍离子螯合亲和层析和DEAE离子交换层析纯化后,融合蛋白纯度达到96%。Westernblotting杂交表明融合蛋白具有人血清白蛋白和人β干扰素的抗原性,细胞病变抑制法测定IFNβ-HSA比活性为1.96×107IU/mg。建立了融合蛋白的生产工艺,为IFNβ-HSA的临床前研究奠定了基础。