胰岛素样生长因子结合蛋白2对高血糖环境诱导人足细胞凋亡的影响及机制研究

背景糖尿病肾病患者日益增加,仍有患者在现有治疗中进展为终末期肾病,因此迫切需要新型治疗靶点。目的探讨胰岛素样生长因子结合蛋白2(insulin like growth factor binding protein 2,IGFBP2)对高血糖环境诱导人足细胞凋亡的影响及机制。方法体外培养的人足细胞随机分为正常血糖(normal glucose,NG)组(5 mmol/L)以及高血糖(high glucose,HG)24 h组、HG 48 h组、HG 72 h组(30 mmol/L)。采用RT-qPCR法检测IGFBP2、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor,TNF-α)和细胞间黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)mRNA表达水平,Western blot检测IGFBP2和Cleaved Caspase 3蛋白表达水平,以此确定后续实验HG处理的最佳时间点。将IGFBP2小干扰RNA转染进入足细胞并分为NG组、阴性对照干预组(NG-NC-siRNA)、IGFBP2敲低siRNA干预组(NG-IGFBP2-siRNA1、NG-IGFBP2-siRNA2、NG-IGFBP2-siRNA3),RT-qPCR检测IGFBP2 mRNA表达水平,选择敲低效率最高的IGFBP2-siRNA用于后续实验。根据实验内容将足细胞随机分为:(1)NG组和HG组;(2)NG组和NG+125 ng/mL rhIGFBP2组;(3)HG组和HG-IGFBP2-siRNA组。(1)(2)(3)均通过RT-qPCR检测TNF-α和ICAM-1 mRNA表达水平,JC-1染色法检测线粒体膜电位,共聚焦显微镜检测线粒体超氧化物和活性氧荧光强度,流式细胞术检测细胞凋亡率。结果随HG处理时间增加,RT-qPCR结果显示IGFBP2、TNF-α和ICAM-1 mRNA水平随时间升高,Western blot结果显示IGFBP2和Cleaved Caspase 3蛋白水平随时间升高。与NG组比较,RT-qPCR结果显示IGFBP2、TNF-α和ICAM-1均在HG 72 h时mRNA水平最高(P<0.05),Western blot结果显示IGFBP2在HG 72 h时和Cleaved Caspase 3在HG 48 h时蛋白水平最高(P<0.05),据此选72 h为后续实验诱导时间点。RT-qPCR检测结果显示,与NG组相比,阴性对照干预组mRNA表达无统计学差异(P>0.05),NG-IGFBP2-siRNA2组IGFBP2 mRNA表达水平最低(P<0.05),敲除效率最高,因此选择IGFBP2-siRNA2进行后续实验。与NG组相比较,HG组线粒体膜电位绿/红色荧光强度比值、线粒体超氧化物和活性氧荧光强度以及细胞凋亡率均增强(P<0.05)。与NG组相比较,NG+125 ng/mL rhIGFBP2组的TNF-α和ICAM-1 mRNA水平、线粒体膜电位绿/红色荧光强度比值、线粒体超氧化物和活性氧荧光强度以及细胞凋亡率均升高(P<0.05)。与HG组相比较,HG-IGFBP2-siRNA组的TNF-α和ICAM-1 mRNA表达水平、线粒体膜电位绿/红色荧光强度比值、线粒体超氧化物和活性氧荧光强度以及细胞凋亡率均降低(P<0.05)。结论敲除IGFBP2后通过减弱高血糖处理下的线粒体功能紊乱和氧化应激降低人足细胞凋亡,因此抑制IGFBP2的表达有望成为糖尿病肾病的潜在治疗策略。

尿液外泌体蛋白质组学在糖尿病肾病无创性诊断中价值

目的筛选糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)患者与单纯2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)患者尿液外泌体中最优差异表达蛋白,探讨蛋白质组学在T2DM患者DN诊断中的价值。方法经肾脏穿刺活检组织病理检查确诊的DN患者12例,随机选取4例为DN筛选蛋白组,余8例DN患者为DN蛋白验证组;单纯T2DM不合并肾功能损害患者8例,随机选取4例为T2DM筛选蛋白组,余4例为T2DM蛋白验证组。分别收集DN筛选蛋白组与DN蛋白验证组患者肾脏穿刺活检前及T2DM筛选蛋白组与T2DM蛋白验证组患者晨起尿液标本,采用超高速离心联合0.22μm超滤法分离纯化尿液外泌体,应用透射电镜观测尿液外泌体形态特征,采用纳米颗粒跟踪分析尿液外泌体粒径;采用Western blot法检测4组尿液外泌体中经典外泌体识别蛋白ALIX、TSG101、Syntenin、CD9阳性表达情况;采用数据非依赖性采集质谱法鉴定4组患者尿液外泌体蛋白质及其表达量,分析DN筛选蛋白组与T2DM筛选蛋白组肾脏疾病生物途径相关的最优差异表达蛋白;比较DN蛋白验证组与T2DM蛋白验证组最优差异表达蛋白表达量;绘制ROC曲线,评估尿液外泌体最优差异表达蛋白对DN的诊断效能。结果分离纯化的尿液外泌体均符合尿液外泌体双层膜泡结构特征,符合外泌体粒径,经典外泌体识别蛋白ALIX、TSG101、Syntenin或CD9阳性表达均>3个,提示尿液外泌体分离纯化成功。DN筛选蛋白组与T2DM筛选蛋白组尿液外泌体中共鉴定出3 654个蛋白,差异性表达蛋白1 133个,其中DN筛选蛋白组467个蛋白表达较T2DM筛选蛋白组降低[log_(2)(FC)≤-1,P<0.05],666个蛋白表达较T2DM筛选蛋白组升高[log_(2)(FC)≥1,P<0.05];根据差异表达排名及肾脏疾病生物途径筛选出C8G[log_(2)(FC)=8.500]、CD5L[log_(2)(FC)=8.330]、C5[log_(2)(FC)=7.570]、C7[log_(2)(FC)=7.414]、C9[log_(2)(FC)=6.965]、ANXA1[log_(2)(FC)=-3.247]、CALB1[log_(2)(FC)=-2.661]、CLOCK[log_(2)(FC)=-2.649]为最优差异表达蛋白。DN蛋白验证组患者尿液外泌体CD5L、C5、C9蛋白表达量高于T2DM蛋白验证组(P<0.05),CALB1、CLOCK蛋白表达量低于T2DM蛋白验证组(P<0.05);C8G、C7、ANXA1蛋白表达量与T2DM蛋白验证组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。DN与T2DM患者尿液外泌体最优差异表达蛋白CALB1、C9、CD5L、C5表达量最佳截断值分别为0.36×10^(5)、1.70×10^(5)、0.77×10^(5)、1.04×10^(5)时,诊断DN的AUC分别为0.969(95%CI:0.876~1.000,P=0.011)、0.906(95%CI:0.720~1.000,P=0.027)、0.906(95%CI:0.733~1.000,P=0.027)、0.938(95%CI:0.796~1.000,P=0.017),灵敏度分别为100.0%、87.5%、75.0%、87.5%,特异度分别为87.5%、100.0%、100.0%、100.0%。结论蛋白质组学有助于筛选尿液外泌体中与肾脏疾病生物途径相关差异表达蛋白质,CALB1、C9、CD5L、C5可能作为T2DM患者诊断DN的无创生物学标志物。

蛋白质组学及代谢组学在糖尿病肾病研究中的应用

糖尿病肾病是终末期肾病的最主要原因之一,已成为世界公共卫生的重大难题,解决临床诊疗方面的争议成为急需。本文综述了利用蛋白质组学及代谢组学技术在糖尿病肾病诊断及鉴别诊断、疾病进展、预后判断及疗效评估方面的研究进展。并对两种组学技术的异同进行阐述,在当代大数据及人工智能的背景下展望了利用蛋白质组学及代谢组学进行整合组学和精准医学研究。

尿沉渣miRNA表达谱在糖尿病肾病无创诊断中意义

目的探讨糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)患者尿沉渣microRNA表达谱在DN无创性诊断中的价值。方法6例DN患者和9例非糖尿病肾病(non-diabetic renal disease,NDRD)患者为筛选队列,采用Human microRNA V21.0芯片筛选尿沉渣中差异性表达的microRNAs。24例DN患者(DN组)和49例NDRN患者(NDRN组)为验证队列,采用实时荧光定量PCR法检测2组差异性表达的microRNAs相对表达量,并绘制ROC曲线,评估差异性表达的microRNAs在无创性DN诊断中的价值。结果6例DN患者和9例NDRD患者尿沉渣中筛选出8个差异性表达的microRNAs。DN组患者尿沉渣中miR-31-3p、miR-135b-5p、miR-1290相对表达量(0.551±0.159、0.374±0.104、0.266±0.066)明显高于NDRD组(0.191±0.440、0.143±0.027、0.108±0.013)(P<0.05),miR-7109-5p、miR-665、miR-4697-5p、miR-486-5p、miR-365a-3p相对表达量与NDRD组比较差异无统计学意义(P>0.05)。差异性表达的miR-31-3p、miR-135b-5p和miR-1290相对表达量的最佳截断值分别为0.216、0.087、0.156时,无创性诊断DN的AUC分别为0.691(95%CI:0.562~0.820)、0.698(95%CI:0.576~0.820)、0.653(95%CI:0.502~0.804),灵敏度分别为54.2%、79.2%、58.3%,特异度分别为79.2%、55.1%、86.4%。结论DN患者尿沉渣中miR-31-3p、miR-135b-5p、miR-1290有可能成为DN特异性无创诊断标志物。

HIF-PHD轴在肾脏缺血再灌注损伤中的作用

缺血再灌注是急性肾损伤(AKI)中肾功能迅速恶化的主要原因。在AKI过程中,HIF发挥重要作用。本文就HIF-PHD轴的概念、调节机制及其在肾损伤缺血再灌注中的作用进行综述,以更好了解急性肾损伤的保护机制,寻找新的治疗靶点和肾脏保护方法。

线粒体通透性转换孔在肾脏缺血再灌注损伤中的作用

肾脏缺血再灌注损伤是在肾移植等术后发生的损伤,发生率高,发生机制复杂且尚不清楚,并缺乏有效的防治措施。在肾脏缺血再灌注损伤过程中,线粒体发挥重要作用,其中线粒体通透性转换孔(mPTP)这一大分子复合物在应激状态下持续开放将导致一系列功能紊乱进而介导组织损伤。理解mPTP的结构和功能会让我们更加了解肾脏缺血再灌注损伤的发生机制,有助于我们寻找新的治疗靶点,提出新的肾脏保护治疗方法。

足细胞损伤时细胞周期调控及MDM2-p53通路作用的研究进展

在肾脏疾病中,足细胞稳态对其功能的维持至关重要。当成熟足细胞受损后,就会因不适当的周期调控而出现有丝分裂灾难。其中MDM2-p53通路参与调节多种细胞周期信号通路,是平衡足细胞周期调控的核心因素,被认为是有前景的治疗靶点之一。本综述就足细胞损伤时的细胞周期信号、MDM2-p53通路作用以及细胞周期调控的相关药物选择进行了综述。