副猪嗜血杆菌5个重组蛋白的小鼠免疫保护效力比较

为筛选副猪嗜血杆菌(GPS)亚单位疫苗的优势保护性抗原,本研究利用大肠杆菌BL21系统表达了GPS重要抗原r Hps06257、r D15和r Hps0675,及Hps0675 N端和C端的重组蛋白r Hps0675-N和r Hps0675-C,并通过SDS-PAGE检测各重组蛋白的表达情况。利用His标签蛋白纯化试剂盒纯化5个重组蛋白后,分别与Montanide^(TM)ISA 201 VG佐剂混合制成亚单位疫苗,对小鼠进行2次免疫,并分别在小鼠首免前、一免后21 d和二免后14 d(即首免后35 d)经尾根静脉采血分离血清,利用间接ELISA方法检测各组小鼠的抗体水平。二免后14 d分别利用5倍半数致死剂量(LD_(50))的5型GPS H5L3株和12型GPS H12L3株菌液对小鼠进行腹腔攻毒,攻毒后14 d内观察并记录各组小鼠的临床症状、发病及死亡情况,统计各组小鼠的免疫攻毒保护率。SDS-PAGE检测结果显示,5个重组蛋白均以包涵体形式表达,其表达量占菌体总蛋白的27.46%~42.37%。ELISA检测结果显示,各蛋白疫苗免疫组小鼠的Ig G抗体水平随免疫次数的增加而升高,与PBS对照组相比差异均极显著(P<0.01)。攻毒试验结果显示,分别利用5 LD_(50)GPS 5型H5L3株菌液和12型H12L3株菌液攻毒后,PBS和BL21菌体蛋白对照组小鼠攻毒后24 h内开始发病,3 d内全部死亡;发病小鼠主要症状为精神沉郁,食欲减退或废绝,被毛紊乱,对外界刺激无明显反应等;对死亡小鼠剖检可见其各组织器官的多发性浆膜炎和败血症性病理学变化。各蛋白疫苗免疫组小鼠中也出现了不同程度的发病和死亡情况,其中利用5 LD_(50)H5L3株攻毒后,r Hps06257、r D15、r Hps0675、r Hps0675-N和r Hps0675-C对免疫组小鼠的保护率分别为80%、0、0、40%和80%;利用5 LD_(50)H12L3株攻毒后,上述各组蛋白疫苗对小鼠的保护率分别为80%、20%、20%、10%和60%。本研究首次证实重组蛋白r Hps06257和r Hps0675-C能够诱导小鼠产生较强的免疫保护效力,具有作为亚单位疫苗靶抗原的潜力,为GPS亚单位疫苗候选保护性抗原的筛选奠定基础。

副猪格拉瑟菌4个抗原蛋白的小鼠免疫保护效力比较

为筛选可用于副猪格拉瑟菌(GPS)亚单位疫苗的优势保护性抗原,本研究利用原核表达系统表达GPS的CyaY、SmpA、AfuA和OppA14个抗原的重组蛋白,采用His标签蛋白纯化试剂盒纯化这4个重组蛋白后,通过SDS-PAGE检测各重组蛋白的表达及纯化效果,采用western blot检测各重组蛋白的反应原性。SDS-PAGE检测结果显示,4个重组蛋白r CyaY、r SmpA、rAfuA和rOppA1的分子量分别约为12 ku、16 ku、41 ku和62 ku,均主要以可溶性形式表达,其表达量占菌体总蛋白的16.50%~26.50%。4个重组蛋白的纯化效果均较好,其浓度介于1.00 mg/mL~4.00 mg/mL。Western blot结果显示,rOppA1和rAfuA与GPS猪阳性血清的反应原性最强,rCyaY的反应原性中等,rSmpA的反应原性最弱。采用超微量核酸蛋白浓度测定仪测定4个重组蛋白的浓度后分别与ISA 201佐剂混合制成疫苗,对小鼠经皮下注射方式免疫2次,分别在小鼠免疫前、首免后21 d和二免后14 d采血,采用间接ELISA方法检测各组小鼠血清中的抗体水平;二免后14 d分别以5 LD_(50)(8.40×10^(8)cfu)和10 LD_(50)(1.68×10^(9)cfu)的5型GPS H5L3株对小鼠经腹腔攻毒,统计各重组蛋白疫苗对小鼠的免疫攻毒保护率。ELISA结果显示,各重组蛋白疫苗免疫组小鼠血清中IgG抗体水平随免疫次数的增加而升高,且均与PBS对照组抗体水平差异极显著(P<0.01)。小鼠攻毒试验结果显示,采用5 LD_(50)H5L3株攻毒后,rCyaY、rSmpA、rAfuA和rOppA1蛋白疫苗对小鼠的免疫保护率分别为83.3%(5/6)、83.3%(5/6)、33.3%(2/6)和100%(6/6);采用10 LD_(50)H5L3株攻毒后,rCyaY、r SmpA和rOppA1蛋白疫苗仍能对小鼠提供33.3%(2/6)、16.7%(1/6)和50%(3/6)的免疫保护率,但rAfuA蛋白疫苗不能为小鼠提供有效的免疫保护力(0/6)。本研究首次在相同条件下表达了GPS的4个重要保护性重组抗原蛋白rCyaY、rSmpA、r AfuA和r OppA1,并评价了它们对小鼠的免疫保护效力,证实rOppA1具有成为亚单位疫苗候选抗原的潜力,该研究为GPS亚单位疫苗的研发提供了更多的参考依据。

副猪嗜血杆菌7型微量凝集试验抗体检测方法的建立

近年来,7型副猪嗜血杆菌的分离率明显升高。为建立该菌抗体的快速检测方法,本研究以副猪嗜血杆菌7型GS122株灭活菌体为抗原,通过优化各反应条件建立了微量凝集试验(MAT)抗体检测方法。结果显示,凝集抗原的最佳反应浓度为2.0×10^(9)CFU/m L,最佳反应温度和时间为37℃、8~9 h。采用该方法对猪瘟、猪链球菌病等9种常见猪传染病阳性血清的检测结果均为阴性(效价≤1∶2),与4型、5型和12型有轻微的交叉反应(效价≤1∶4)。敏感性试验和疫苗免疫抗体检测结果显示,该方法能检测到副猪嗜血杆菌7型GS122株灭活疫苗免疫仔猪后第14天的血清抗体(效价≥1∶4),首免后第21天和二免后第14天(首免后第35天)的血清抗体效价分别达到1∶16和1∶32以上。重复性试验表明,批内、批间重复性良好。利用该方法对718份临床血清样品的检测结果表明,在河南省部分区域的猪群中存在副猪嗜血杆菌7型感染。本研究结果为副猪嗜血杆菌7型的疫苗抗体评价和流行病学调查奠定了基础。