斑马鱼及其在环境毒理学中的应用

斑马鱼是一种热带淡水鱼,饲养简单,管理方便,易于获取。斑马鱼常年产卵,世代周期短,一般3-4个月就能达到性成熟。其胚胎透明,并且在体外发育,易于观察。长期以来斑马鱼一直被广泛地运用于发育生物学和毒理学的研究中。近年来,众多研究显示了斑马鱼应用于环境毒理学研究中有其独特的优势,并已逐渐成为环境毒理学家们的新宠。利用转基因斑马鱼对污染物进行快速监测已成为目前研究的热点。

斑马鱼应用于毒理学研究的现况

斑马鱼是一种常见的热带淡水鱼,体型小,世代周期短,繁殖率高,饲养管理廉价方便, 饲养成本低。其胚胎透明,且在体外受精和发育。这些生物学特性使其成为了毒理学家们的新宠, 目前它已被广泛地用于胚胎发育毒理学、环境毒理学、病理毒理学、药物毒理学等毒理学领域的研究中,并展现出其特有的优势。

实验动物胚胎发育异常图像数据库的国际化合作建设

实验动物胚胎发育异常图像数据库(Dev Tox数据库)是面向全球的、非盈利性的、开放共享的发育毒理学资源库,配有数千张发育异常的图片、说明、术语和统一分类,极大地促进了发育毒理学研究中形态异常描述术语的统一和规范化。Dev Tox数据库集合了欧洲、美洲、亚洲发育毒理学界的研究成果,是一项国际化合作建设项目,需要各国科学家的共同努力,将其建设成为最为全面的发育毒理学图像资源库。Dev Tox数据库中文版已于2016年底正式上线,期待中国科学家为Dev Tox数据库的更新完善做出贡献。

实验用斑马鱼成鱼内脏组织病理学检查方法的优化

目的探索并优化适合于斑马鱼成鱼内脏组织的病理学检查技术。方法将斑马鱼整条固定于Dietrich's固定液后,分段切开,取包含内脏组织的胸腹段,剥除斑马鱼鱼皮,梯度乙醇脱水时间优选为30 min、二甲苯透明、石蜡包埋、沿斑马鱼体轴纵向连续切片、HE染色后用温水冲洗切片进行颜色反蓝,正置显微镜下观察效果。结果经过反复的条件摸索和优化,光学显微镜下观察心脏、肝脏、脾脏、胆囊、肾脏、胰腺、消化道、精巢和卵巢等组织切片和染色的效果,可见斑马鱼组织均切片完整,无折叠或断裂,各脏器的解剖学与组织细胞学结构清晰,易于辨认,细胞核与细胞质染色分明。结论优化后的斑马鱼成鱼内脏组织病理学方法效果较为理想,可获得高质量的内脏组织学标本。

新世纪中国环境与生殖健康的状况和展望

人口、资源、环境是制约各国，特别是中国可持续发展的主要因素。控制人口增长、提高人口素质是中国实现可持续发展的关键问题中的关键。但是。人类在经济生产活动中取得巨大成就的同时，也带来了危及人类自身生存和发展的严重后果。

去氧胆酰酪氨酸对人类精子质膜完整性和细胞凋亡的影响

目的探讨去氧胆酰酪氨酸(DCT)对人类精子活力、质膜完整性以及凋亡的影响。方法上游高活力人类精子分别与DCT 0.25,0.5和1.0 g·L-1作用20 min,取精子悬液分析精子活率(SM)和活力(SV);SYBR-14/PI双染后经过荧光显微镜和流式细胞仪观察质膜完整性,AnnexinⅤ/PI双染流式细胞仪分析细胞凋亡。结果 DCT对SM和SV均有显著的抑制作用,且存在量-效关系(rSV=0.91,rSM=0.88,P<0.05)。质膜完整性结果显示,质膜破损精子在DCT 0.25,0.5和1.0 g·L-1时质膜破损精子百分率分别为(54.3±9.8)%,(73.8±3.5)%和(80.6±8.3)%,与空白对照组具有明显差别(P<0.05),且具有明显的量效关系(r=0.91,P<0.05)。凋亡实验结果显示,晚期凋亡精子百分率在0.25,0.5和1.0 g·L-1时,分别是(11.9±1.2)%,(30.1±6.3)%和(75.6±6.3)%,具有明显的浓度依赖性(r=0.98,P<0.05)。DCT≤0.5 g·L-1引起精子早期凋亡率升高,但是高浓度时却出现降低趋势。结论 DCT不仅破坏精子质膜完整性,同时诱发精子凋亡,导致受精能力降低或消失。

dl-扁桃酸阴道热敏凝胶剂对小型猪阴道黏膜刺激性的研究

目的研究dl-扁桃酸阴道热敏凝胶剂对小型猪阴道黏膜的刺激性。方法将9只雌性小型猪按体质量随机分为空白胶组、讲．扁桃酸阴道热敏凝胶剂组和市售壬苯醇醚凝胶（N-9凝胶）组，肌肉注射苯甲酸雌二醇400μg／kg（促发情），12d后建立小型猪阴道刺激性试验模型，阴道给予5mL凝胶，每日一次，连续给药7d，在给药前和末次给药后的24h与72h，收集阴道灌流（CVL）液，流式细胞仪计数炎性细胞和中性粒细胞数目；末次给药72h后处死小型猪，取阴道组织，观察阴道黏膜组织病理学改变。结果dl-扁桃酸阴道热敏凝胶剂组CVL液中炎性细胞、中性粒细胞数目明显低于N-9凝胶组（P〈0．05）。小型猪阴道黏膜组织HE染色显示，dl-扁桃酸阴道热敏凝胶剂处理组阴道黏膜无明显上皮破损、血管充血以及炎症细胞浸润，其刺激性评分（5．10±0．47），与空白胶组（3．30±1．60）比较无显著性差异（P〉0．05），明显低于N-9凝胶组（20．50±3．50）（P〈0．05）。结论dl-扁桃酸阴道热敏凝胶剂对小型猪阴道黏膜刺激性较小。

环境毒理学研究的重要模式生物--斑马鱼

斑马鱼被广泛应用于环境化学物的监测与评价,并得到经济合作发展组织(OECD)、国际标准化组织(ISO)等权威机构的认可。本文简述了斑马鱼应用于环境毒理学研究的诸多优势,综述了斑马鱼作为仅次于小鼠应用广泛的模式生物,被用于环境中许多化学物,包括发育毒性与致畸、致癌毒性、胚胎毒性、心血管毒性、神经和行为毒性、特别是生殖毒性在内的一系列环境毒理学研究中,对环境化学物的危害识别和风险评估具有广泛的应用。由于斑马鱼胚胎和幼鱼体型小,适用于高内涵分析,可结合转基因技术、基因组学和蛋白组学技术,将其应用于环境毒理学机制研究中。

dl-扁桃酸对人精子与阴道黏膜上皮VK2/E6E7细胞的毒性研究

目的探讨dl-扁桃酸对人阴道黏膜上皮细胞(VK2/E6E7)与精子的细胞毒性损伤。方法不同浓度的dl-扁桃酸处理高活力精子20 s,计算机辅助精子分析仪测定精子活率,扫描电子显微镜检测精子受损情况。1.25,2.5 g·L?1 dl-扁桃酸和4.0 g·L?1壬苯醇醚(nonoxynol-9,N-9)处理VK2/E6E7细胞,MTT法检测细胞活性,ELISA试剂盒检测乳酸脱氢酶(LDH)释放率,并用流式细胞法检测细胞凋亡率。结果 dl-扁桃酸抑制精子活率的半数有效浓度约为1.25 g·L?1,最低有效浓度约为2.5 g·L?1。扫描电镜结果显示,dl-扁桃酸处理组精子表面结构与对照组形态相似,无明显受损特征,N-9组精子严重受损。MTT实验结果表明,1.25 g·L?1 dl-扁桃酸组细胞存活率>95%,2.5 g·L?1 dl-扁桃酸组细胞存活率约为50%。1.25,2.5 g·L?1 dl-扁桃酸处理组LDH释放量只有微量检出,远低于N-9组。流式细胞检测表明,1.25,2.5 g·L?1 dl-扁桃酸处理组中活细胞和晚期凋亡比例与对照组相近,早期凋亡细胞略少于对照组,死亡细胞稍多于对照组,N-9组大量细胞死亡。结论 dl-扁桃酸对VK2/E6E7细胞毒性远低于N-9,其对精子的抑制作用不是通过破坏精子质膜与鞭毛来实现。

dl-扁桃酸对精子质膜及顶体的完整性和线粒体膜电位的影响

目的：研究dl-扁桃酸（dl-mandelic acid）的抑精作用及其机制。方法：dl-扁桃酸0.5-10.0g·L^-1处理高活力精子20 s,计算机辅助精子分析仪（computer assistant spermanalysis,CASA）测定精子活率、精子直线运动速率（VSL）、曲线运动速率（VCL）、平均路径速率（VAP）、侧摆幅度（ALH）、精子运动向前性（STR）和精子运动直线性（LIN）;流式细胞（SYBR-14/PI）检测精子质膜完整性,采用FITC标记的豌豆凝集素荧光染色观察精子顶体完整性;FITC-PSA/PI/JC-1荧光染色检测精子线粒体膜电位变化。结果：随着dl-扁桃酸浓度的升高,精子活率与精子直线运动速率（VSL）、曲线运动速率（VCL）、平均路径速率（VAP）、侧摆幅度（ALH）、精子运动向前性（STR）和精子运动直线性（LIN）显著降低,dl-扁桃酸抑制精子活率的半数有效浓度（EC50）约为1.25 g·L^-1,最低有效浓度（MEC）约为2.5 g·L^-1。流式细胞仪检测表明,dl-扁桃酸对精子质膜完整性无影响。荧光染色检测表明,dl-扁桃酸处理组精子顶体受损,精子线粒体膜电位降低。结论：dl-扁桃酸通过影响精子顶体和降低线粒体膜电位,对精子起到抑制作用。

荧光转基因斑马鱼Tg(ere-vtg:egfp)质粒的构建及验证

[目的]本研究旨在构建一种对17α-炔雌醇(17α-ethynylestradiol,EE2)敏感的荧光转基因斑马鱼模型,提供一种可直观地监测水中环境雌激素(environmental estrogens,EEs)污染程度的生物检测方法。[方法]构建Tg(ere-vtg:egfp)质粒,显微注射到1~2个细胞期的斑马鱼胚胎中,经10 ng/L EE2暴露发出绿色荧光,建立能稳定遗传的Tg(ere-vtg:egfp)转基因斑马鱼系。将转基因斑马鱼纯合子幼鱼和胚胎暴露于不同浓度的EE2进行敏感性鉴定,并将转基因斑马鱼纯合子幼鱼暴露于多种EEs、雌激素结构类似物中进行特异性鉴定。[结果]经显微注射Tg(ere-vtg:egfp)质粒并进行基因筛选,成功构建Tg(ere-vtg:egfp)转基因斑马鱼。EE2诱导Tg(ere-vtg:egfp)转基因斑马鱼表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)与浓度、时间有关。当EE2质量浓度大于0.1 ng/L(131 hpf)时,可见转基因斑马鱼胚胎表达明显的GFP。当暴露于不同结构的雌激素类化合物时,Tg(ere-vtg:egfp)转基因斑马鱼幼鱼呈现GFP表达,而对于非雌激素类化合物在各浓度下均没有GFP表达。[结论]采用Tg(ere-vtg:egfp)转基因斑马鱼可直观地动态监测环境中EEs污染情况。

维甲酸诱导SD大鼠胚胎骨骼畸形的图像分析

[目的]运用维甲酸诱导大鼠胚胎畸形模型,探索维甲酸诱导大鼠胚胎畸形的剂量反应关系,为实验动物发育毒理学畸形解剖图像(DevTox)数据库补充大鼠胚胎骨骼畸形图片数据。[方法]将SD大鼠孕鼠随机分为4组,即对照组、50、100、150 mg/kg维甲酸组。各组在孕第10天灌胃给药1次,孕第20天处死孕鼠,取出胚胎,观察记录各组胚胎总数与发育情况。胚胎骨骼经茜素红染色,观察胚胎各部位骨骼畸形及发生率,并在解剖镜下摄取畸形图片。[结果] 50 mg/kg及以上剂量组的维甲酸可诱导SD大鼠胚胎骨骼出现明显的多发性畸形,致畸率可达100%,畸形主要表现为下颌骨缺失、上颌骨与颧弓融合;胸骨节缺失;第10~13节胸椎融合、缺失;腰椎融合、缺失;骨盆带骨骼与尾椎缺失等。维甲酸各组骨骼畸形的表型和畸形发生率呈现出高度的一致性和可重复性,三个剂量组间的胚胎畸形率均为100%,但畸形程度随剂量增高而加重。收集的正常与畸形的图片清晰,无气泡、反光干扰,且分辨率较高。[结论] 50 mg/kg及以上维甲酸在孕第10天灌胃给药,对SD大鼠胚胎骨骼有明显的致畸作用,致畸率高,且畸形类型多样。实验所得骨骼畸形图片可上传DevTox数据库,补充丰富该数据库内容。

乙酸阴道热敏凝胶剂对小型猪阴道黏膜的刺激性

目的:评价乙酸阴道热敏凝胶剂(Acid-TISG)对小型猪阴道黏膜的刺激性。方法:将9只雌性小型猪随机分为空白胶组、Acid-TISG组和市售壬苯醇醚凝胶(N-9 jelly)组,阴道给予5 m L凝胶,qd,连续给药7 d,在给药前和末次给药后的24,72 h,收集阴道灌流液(CVL),流式细胞仪计数炎性细胞和中性粒细胞数目,比较不同给药组之间的差别;末次给药72 h后处死小型猪,取阴道组织,免疫组化法检测阴道黏膜内CD45的表达。结果:Acid-TISG组CVL液中炎性细胞、中性粒细胞数目明显低于N-9 jelly组(P<0.001),与空白胶没有明显差异(P>0.05)。与空白胶组相比,Acid-TISG组的阴道黏膜CD45表达无显著性差异(P>0.05),N-9 jelly组CD45表达显著增加(P<0.05)。结论:乙酸阴道热敏凝胶剂对小型猪阴道黏膜刺激性较小,作为外用避孕药具有一定的应用前景。

链状酰胺类化合物B07的体外杀精效果及其对精子质膜的影响

目的：研究一种链状酰胺类化合物（B07）的体外杀精作用及其对精子质膜的影响。方法：上游收集高活力人类精子分别与0μg／ml（对照组），5-640μg／mlB07作用30min，随后用计算机辅助精液分析仪分析记录精子的活率及运动参数；用160μg／mlB07与精子作用，记录5min、30min、60min和120min时精子活动率：处理后的精子一部分经SYBR-14／PI双染后用荧光显微镜观察，另一部分通过电子显微镜来观察质膜的变化情况；并以壬苯醇醚科9）作为阳性对照。结果：随着B07浓度的升高，精子活率和活力呈下降趋势，最低有效浓度（MEC）为640gg／ml；荧光显微镜下经B07处理的精子呈橙色，而N9处理的精子呈红色；电子显微镜显示B07组精子头部肿胀起泡，尾部针孔样损伤，N9组精子呈溶解性改变。结论：B07具有体外杀精作用，且该作用有时间和浓度依赖性。且其对精子质膜的影响小于N9。

邻苯二甲酸二丁酯对F1代测交斑马鱼原始生殖细胞迁移和精巢毒性研究

目的研究邻苯二甲酸二丁酯(Dibutyl phthalate,DBP)诱导雄性生殖功能异常的传代效应。方法对4~5月龄的成年雄性斑马鱼进行连续30 d的DBP的暴露实验,分别设置空白对照组,溶剂(丙酮0.01%)对照组,0.2、0.6和1.8 mg/L DBP暴露组;暴露后的雄性斑马鱼定义为F0代。各组随机选择20条F0代雄鱼与野生型雌性斑马鱼交配产卵(称F1代测交胚胎)进行实验。F1代受精后6、24、48和72 h(hour post fertilization,hpf),用显微镜观察F1代测交胚胎发育形态改变,测定24hpf自主运动次数和72hpf心率。采用胚胎整体原位杂交技术标记原始生殖细胞(Primordial germ cells,PGCs)迁移;组织病理学检测F1代测交成年斑马鱼精巢特征。结果成年F1代测交雄性斑马鱼精巢发育及功能被抑制,同时存在间质(Leydig)细胞增生与精子数量减少的病理损害特征。DBP(0.6和1.8 mg/L剂量组)暴露后F1代出现小头小眼畸形、弱色素沉着、心包及卵黄囊水肿和脊椎异常等;24hpf自主运动(抽动)减弱,且随DBP浓度增加呈现明显的剂量-效应关系(R^2=0.8929,P<0.05);72hpf心率随着DBP暴露浓度增加逐渐降低,呈现明显的剂量-效应关系(R^2=0.8999,P<0.05)。胚胎整体原位杂交结果显示,1.8 mg/L DBP暴露组的F1代测交斑马鱼发育至24hpf时,PGCs分布异常,部分PGCs没有迁移到生殖脊部位。结论DBP暴露导致成年雄性斑马鱼的生殖异常和胚胎的发育异常可以传递至F1代,可能通过PGCs的迁移异常干扰生殖发育。

大气污染细颗粒物对女(雌)性生殖健康影响的研究进展

近年来,大气污染中的细颗粒物(PM2.5)对人体的健康危害受到持续地广泛关注,然而其对于女(雌)性生殖健康危害的研究尚较为缺乏.文献数据显示,无论是人群调查资料还是动物实验研究,PM2.5暴露可能引起雌性生育能力降低、生殖系统损伤以及多种不良妊娠结局,包括流产、早产、低出生体质量儿和胎盘重量下降等.其作用机制迄今以炎症介质假说、氧化损伤假说和干扰下丘脑-垂体-性腺轴假说被多数人认可.本文基于近十年有关PM2.5对雌性生殖危害的文献,对该领域的研究进展做一综述,可为今后PM2.5雌性生殖毒性的深入研究提供参考.