冠状动脉粥样硬化性心脏病患者血清炎症指标与血脂水平相关性的研究

目的:探讨冠状动脉粥样硬化性心脏病(Coronary atherosclerotic heart disease, CHD)患者血清中炎症指标水平与血脂水平相关性,进一步证明慢性炎症反应是诱发CHD的重要原因。方法:收集我院33例CHD合并高脂血症患者的血清样本和29例单纯CHD患者的血清样本,采用ELISA法检测血清中炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α的水平,结合hs-CRP的水平,分析炎症指标与患者血脂水平TC、TG和LDL-C的相关性。结果:与单纯CHD组相比,CHD合并高脂血症患者的炎症指标hs-CRP、IL-1β和TNF-α与血脂指标TC、TG和LDL-C存在显著的相关性。结论:体内慢性炎症反应在CHD的发生中具有重要意义。

鲍曼不动杆菌外膜囊泡诱发人单⁃核巨噬细胞THP⁃1的炎性反应

目的建立超速离心法纯化鲍曼不动杆菌外膜囊泡(OMVs),并探讨OMVs诱发人单核-巨噬细胞THP-1炎性反应能力。方法大量培养鲍曼不动杆菌标准菌株,从培养液上清中以超速离心法提纯OMVs并以透射电镜观察形态。分别以5和50μg/mL的OMVs与THP-1细胞共培养,RT-qPCR检测NOD样受体家族蛋白(NLRP3)和caspase-1表达量;ELISA检测培养液上清中IL-1β含量;蛋白质印迹法检测细胞自噬相关蛋白LC-3Ⅱ和Beclin-1表达量;酶促动力学法检测细胞caspase-3酶活性;流式细胞测量术检测细胞活性氧表达量。结果成功提纯鲍曼不动杆菌OMVs。OMVs可以诱导THP-1细胞NLRP3炎性复合体活化,并增加自噬相关蛋白LC-3Ⅱ和Beclin-1表达量(P<0.05),以及上调凋亡关键因子caspase-3酶活性(P<0.05)。共培养1 h时,OMVs可以显著上调THP-1细胞活性氧表达(P<0.05)。结论鲍曼不动杆菌OMVs可以显著活化巨噬细胞NLRP3炎性复合体。

整肠生对新型冠状病毒肺炎患者细胞因子水平和临床预后的影响

目的:探讨整肠生(地衣芽孢杆菌活菌胶囊)改善新型冠状病毒肺炎(coronavirus disease-19,COVID-19)患者高细胞因子水平和临床预后的效果,为临床开展肠道微生态疗法提供实验依据。方法:回顾性分析2020年2月至3月武汉市同济医院中法新城院区收治的38例成年重症/危重症COVID-19患者,其中,18例患者接受了整肠生治疗(治疗组),20例患者未接受整肠生治疗(对照组)。两组患者除接受常规治疗外,治疗组患者每天还服用整肠生以调节肠道微生态。记录两组患者临床基本特征,治疗前后白细胞、淋巴细胞及血小板计数,TNF-α、IL-1β、IL-6、PCT、CRP、ALT、白蛋白和肌酐水平,以及临床预后指标。结果:治疗2周后,治疗组和对照组患者外周血中淋巴细胞计数明显高于治疗前(P<0.01),血清C反应蛋白水平显著低于治疗前(P均<0.01),但两组患者间淋巴细胞计数和C反应蛋白差异无统计学意义(P>0.05)。经整肠生治疗2周后,治疗组患者血清中TNF-α和IL-1β水平显著低于治疗前,并低于对照组(P<0.05),但是两组患者的临床结局尚无显著差异(P>0.05)。结论:整肠生可以降低COVID-19患者血清中TNF-α和IL-1β水平,但尚未观察到患者临床结局的显著改善。

表达Panton-Valentine杀白细胞素(PVL)的金黄色葡萄球菌诱导人THP-1单核细胞自噬和凋亡

目的研究表达Panton-Valentine杀白细胞素(PVL)的金黄色葡萄球菌诱导人THP-1细胞自噬和凋亡机制。方法在大肠杆菌中表达重组杀白细胞素(rPVL),并免疫家兔制备多克隆抗血清。采用反转录PCR和Western blot法鉴定表达PVL的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)。分别使用表达PVL的MRSA(MRSA^(PVL+))和不表达PVL的MRSA(MRSA^(PVL-))感染THP-1细胞,于感染后1、3、6 h收集细胞,采用实时定量PCR检测自噬相关基因3(ATG3)、ATG4B、ATG5、ATG7、ATG12;Western blot法检测beclin-1、微管相关蛋白1轻链3(LC3)、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、磷酸化的PI3K(p-PI3K)、蛋白激酶B(AKT)、磷酸化的AKT(p-AKT)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、磷酸化的mTOR(p-mTOR)、裂解型胱天蛋白酶3(c-caspase-3)、caspase-3的蛋白水平;二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)荧光探针负载法检测细胞活性氧(ROS)水平;异硫氰酸荧光素标记的膜联素Ⅴ/碘化丙啶(annexinⅤ-FITC/PI)双标记结合流式细胞术检测细胞凋亡。结果成功制备PVL多克隆抗体,鉴定出1株MRSA^(PVL-)菌和1株MRSA^(PVL+)菌。分别以两株菌与THP-1细胞共培养1 h,MRSA^(PVL+)组仅ATG7表达量显著高于MRSA^(PVL-)组和正常对照组;共培养3 h,MRSA^(PVL+)组ATG7和ATG12表达量高于MRSA^(PVL-)组和正常对照组,其他基因表达量变化不明显。感染1、3、6 h,MRSA^(PVL+)感染组细胞PI3K、AKT和mTOR磷酸化水平显著低于MRSA^(PVL-)感染组和正常对照组;感染1 h和3 h,MRSA^(PVL-)感染组细胞PI3K、AKT和mTOR磷酸化水平显著低于正常对照组;感染6 h,MRSA^(PVL-)菌感染组细胞mTOR磷酸化水平显著低于正常对照组。感染1、3、6 h,MRSA^(PVL+)组细胞ROS水平和凋亡率均高于MRSA^(PVL-)组和正常对照组,且随着感染时间的延长细胞ROS水平和凋亡率持续增加;MRSA^(PVL-)组细胞ROS水平和凋亡率也高于正常对照组。结论MRSA^(PVL+)对THP-1细胞PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制作用更强,可促进ATG12/ATG7/ATG5自噬通路活化增加THP-1细胞自噬;同时,MRSA^(PVL+)诱导THP-1细胞ROS产生增加,促进细胞凋亡。

微信公众平台在医学检验专业本科生科研能力培养中的应用

医学检验技术专业要求大学生应具有一定的科研能力,其中包括优秀的实验操作技能和良好的科研思维,因此本科阶段培养和提高学生科研能力尤为重要。本课题组借助微信在学生群体中的广泛普及,针对医学检验专业本科学生进行了以微信公众平台作为教学辅助手段的实践探索。通过与往届学生进行对比,并辅以调查问卷对实践效果的分析总结,发现该微信教学平台的应用对提高学生培养科研能力的积极性,及时解决学生实践操作和科研训练中遇到的问题等均具有重要作用。

不同浓度丁酸钠抑制氧化型低密度脂蛋白诱导THP-1细胞炎症反应的研究

目的探讨不同浓度的丁酸钠抑制氧化型低密度脂蛋白(Ox-LDL)诱发人单核巨噬THP-1细胞炎症反应能力及其机制。方法分别使用终浓度为50、100、200、400、800μmol/L的丁酸钠预处理THP-1细胞24 h,再以终浓度为50 mg/L的Ox-LDL刺激THP-1细胞24 h,采用实时荧光定量PCR法和ELISA法检测IL-1β、TNF-α、IL-10和TGF-β表达量,实时荧光定量PCR法和免疫印迹法检测NLRP3和Caspase-1的表达量,免疫印迹法检测自噬相关蛋白LC3-Ⅱ和Beclin-1的表达量,以及NF-κB p65在细胞核和胞浆中的分布情况。本研究同时设置正常对照组和无丁酸钠预处理的Ox-LDL组。结果与Ox-LDL组比较,分别经终浓度为200、400、800μmol/L丁酸钠预孵育后,THP-1细胞IL-10和TGF-β表达量显著升高(P<0.01);50、100、200、400μmol/L丁酸钠预处理组细胞TNF-α表达量明显下降(P<0.01);50和100μmol/L丁酸钠预处理组细胞IL-1β表达量明显下降(P<0.01);50、100、200、400、800μmol/L丁酸钠预处理组细胞Caspase-1表达量明显下降(P<0.01);仅400和800μmol/L丁酸钠预处理组细胞NLRP3蛋白表达量明显下降(P<0.01),其他浓度丁酸钠抑制效果不明显。Ox-LDL刺激后THP-1细胞NF-κB p65蛋白明显由细胞浆移位至细胞核内(P<0.01),而经50、100、200、400、800μmol/L丁酸钠预处理后,NF-κB p65蛋白核转位现象明显受到抑制(P<0.01)。与Ox-LDL组比较,200、400、800μmol/L丁酸钠可以显著上调THP-1细胞Beclin-1表达量(P<0.01),50、100、200、400、800μmol/L丁酸钠可以显著上调LC3-Ⅱ表达量(P<0.01)。结论丁酸钠可以抑制由Ox-LDL诱发的THP-1细胞炎症反应,其可能的机制是通过上调THP-1细胞自噬水平,抑制THP-1细胞NF-κB信号通路和NLRP3炎症复合体活化而产生抗炎效果。本结果为采用“肠道微生物组-免疫炎症轴”理论干预高血脂患者体内慢性非可控性炎症提供了实验依据。

自制多抗检测金黄色葡萄球菌PVL蛋白的研究

目的:携带杀伤白细胞素(pvl)基因的耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌毒力强,可以诱发高致死率的社区获得性肺炎,但目前仍缺少快速简便的检测方法。本研究拟制备抗PVL多克隆抗体用于其快速检测。方法:本研究通过将金黄色葡萄球菌PVL蛋白S亚基的重组质粒LukS-PV/pET28a导入大肠杆菌诱导表达重组蛋白,再经免疫新西兰兔制备抗血清,以Western blotting法检测金黄色葡萄球菌PVL蛋白表达。结果:成功纯化出重组LukS-PV蛋白,并制备抗LukS-PV抗血清。通过Western blotting法采用自制多克隆抗体成功检测出金黄色葡萄球菌PVL表达。结论:自制抗PVL多克隆抗体可以检测金黄色葡萄球菌PVL表达,为下一步试剂盒制备奠定技术基础。

鲍曼不动杆菌OmpA经ROS/NLRP3信号通路调控THP-1细胞自噬和凋亡

目的:探讨鲍曼不动杆菌外膜蛋白A(outer membrance protein A,OmpA)对人单核巨噬THP-1细胞自噬和凋亡的影响及其可能机制。方法:构建OmpA/pET-28a载体,转化大肠埃希菌BL21(DE3)表达纯化重组OmpA蛋白,并免疫家兔制备多克隆抗体;采用蛋白质印迹法检测呼吸机相关性肺炎患者发病前后血清中OmpA抗体水平变化。以不同浓度(1、10μg/mL)重组OmpA蛋白分别刺激THP-1细胞1、3、6 h,采用蛋白质印迹法检测自噬相关蛋白LC-3和Beclin-1表达,流式细胞术检测细胞凋亡率及活性氧产生,荧光实时定量PCR检测细胞含NLR家族Pyrin域NOD样受体家族3(NLRP3)、Caspase-1和IL-1β等mRNA表达。结果:自制多抗可以识别临床菌株OmpA蛋白。呼吸机相关性肺炎患者发病前后,血清中均可检出OmpA抗体(IgG型),且发病后OmpA抗体水平显著高于气管插管前(P<0.05)。重组OmpA蛋白刺激THP-1细胞后,细胞自噬相关蛋白LC3-Ⅱ和Beclin-1表达显著上升,细胞凋亡率显著升高,呈一定的时间和浓度依赖性(P<0.05)。与对照组比,在重组OmpA蛋白作用1 h时,细胞IL-1βmRNA表达和活性氧含量显著增加(P<0.05);3 h和6 h时,3种mRNA表达量和活性氧含量显著降低(P<0.05)。结论:OmpA通过激活THP-1细胞NLRP3炎症小体,释放活性氧和IL-1β等炎症介质,诱导THP-1细胞自噬和凋亡发生。

3种主要短链脂肪酸减轻5-氟尿嘧啶诱发的THP-1细胞炎症反应

目的:研究3种主要短链脂肪酸(short-chain fatty acids,SCFAs)即乙酸钠、丙酸钠和丁酸钠,对5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil,5-FU)诱发人单核巨噬THP-1细胞炎症反应的影响及其可能机制。方法:将THP-1细胞分为5组:对照组,细胞未经任何处理;5-FU组,2.5 mmol/L 5-FU处理细胞24 h;5-FU+乙酸钠组、5-FU+丙酸钠组、5-FU+丁酸钠组,均经100μmol/L相应SCFAs预处理24 h,再加入2.5 mmol/L 5-FU处理24 h。采用qRT-PCR法检测细胞炎症相关因子mRNA表达量;ELISA法检测细胞上清液中IL-1β、IL-6和IL-10含量;蛋白质印迹法检测细胞Toll样受体9(TLR9)、NOD样受体家族3(NLRP3)、Caspase-1、LC3-Ⅱ、Beclin-1表达量,以及细胞核和胞质中核因子-κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)p65蛋白表达量;流式细胞术检测细胞活性氧水平。结果:与对照组相比,5-FU组TLR9、NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-6、LC3-Ⅱ、Beclin-1、胞核NF-κB p65蛋白表达量以及活性氧水平显著增加(P均<0.01)。与5-FU组比较,5-FU+乙酸钠组TLR9表达量显著降低(P<0.01);5-FU+丙酸钠组IL-1β表达量以及活性氧水平显著降低(P<0.01);5-FU+丁酸钠组IL-1β表达量以及核内NF-κB p65蛋白表达量显著减少(P<0.01),而胞质内表达量显著增加(P<0.01);3种SCFAs预处理均可以显著降低NLRP3、Caspase-1、IL-6、LC3-Ⅱ及Beclin-1表达量(P<0.01),并增加抗炎因子IL-10表达量(P<0.01)。结论:乙酸钠、丙酸钠和丁酸钠3种SCFAs可以显著抑制由5-FU诱发的THP-1细胞炎症反应,并抑制细胞自噬水平,减少细胞活性氧生成量,其可能是通过抑制TLR9/NF-κB/ROS途径产生抗炎作用。

我院鲍曼不动杆菌携带bla_(OXA-23)基因及其耐药机制研究

目的研究我院分离鲍曼不动杆菌携带bla_(OXA-23)基因的携带情况及其诱导细菌耐药机制。方法收集江阴市青阳医院2019年1月至2019年12月间临床分离鲍曼不动杆菌,经VITEK-2全自动微生物鉴定及药敏分析系统鉴定耐亚胺培南菌株100株,敏感菌株100株。通过多重PCR法检测上述菌株中bla_(OXA-23)、bla_(OXA-24)、blaOXA-51和bla_(OXA-58)基因携带情况。通过PCR法扩增亚胺培南耐药的鲍曼不动杆菌bla_(OXA-23)的ORF序列,构建过表达载体bla_(OXA-23)/pYMAb3并电转化鲍曼不动杆菌(ATCC 17978),以硫酸卡那霉素和美罗培南共同筛选过表达bla_(OXA-23)基因的菌株。采用稀释法检测转化bla_(OXA-23)/pYMAb3载体和pYMAb3空载体的菌株对亚胺培南的MIC。结果我院耐亚胺培南的鲍曼不动杆菌均携带bla_(OXA-23),敏感株未检出携带该基因。RT-PCR法可检出转化bla_(OXA-23)/pYMAb3载体菌株表达bla_(OXA-23)基因,而转化pYMAb3空载体菌株未检出bla_(OXA-23)基因表达。转化bla_(OXA-23)/pYMAb3载体菌株对亚胺培南MIC为32μg/mL,转化空载体菌株MIC仅为0.5μg/mL。结论我院耐亚胺培南的鲍曼不动杆菌均携带bla_(OXA-23)基因,可以作为耐药菌株筛选的分子标记。由质粒携带的bla_(OXA-23)基因是诱发我院鲍曼不动杆菌耐药的重要原因,在院感工作中需高度重视。

社区获得性呼吸窘迫综合征(CARDS)肺炎支原体毒素促进THP-1细胞自噬并激活NLRP3炎性体

目的研究社区获得性呼吸窘迫综合征(CARDS)肺炎支原体(Mp)毒素诱导THP-1细胞自噬以及活化含pyrin结构域核苷酸结合寡聚结构域样受体家族3(NLRP3)炎性体的能力和机制。方法采用原核表达技术获得重组CARDS(rCARDS)Mp毒素,5μg/mL和10μg/mL rCARDS Mp毒素作用THP-1细胞20 min、40 min、1 h、2 h和3 h。Western blot法检测THP-1细胞自噬相关蛋白beclin-1、微管相关蛋白1轻链3Ⅱ(LC3Ⅱ)和P62表达水平,实时定量PCR检测THP-1细胞NLRP3、胱天蛋白酶1(caspase-1)和白细胞介素1β(IL-1β)的mRNA水平,2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯染色检测THP-1细胞活性氧(ROS)水平。结果与正常细胞对照组相比,rCARDS毒素作用1 h内,THP-1细胞beclin-1、LC3和P62表达量随着作用时间延长明显增加;rCARDS毒素作用2 h和3 h时,beclin-1、LC3和P62表达量降低。rCARDS Mp毒素作用THP-1细胞20 min和40 min时,5μg/mL、10μg/mL rCARDS Mp毒素组细胞NLRP3表达量无显著差别,但在各时间点,rCARDS Mp毒素处理的THP-1细胞NLRP3 mRNA水平均显著高于正常对照组,且作用1 h和2 h时,10μg/mL组细胞NLRP3 mRNA水平显著高于5μg/mL组,而3 h时5μg/mL组和10μg/mL组细胞NLRP3 mRNA水平均低于2 h时。rCARDS Mp毒素作用40 min、1 h和2 h时,不同剂量rCARDS Mp毒素组细胞caspase-1 mRNA水平均高于正常细胞对照组,作用40 min、1 h、2 h和3 h时,10μg/mL组细胞caspase-1 mRNA水平均显著高于5μg/mL组。与正常细胞对照组相比,rCARDS Mp毒素作用20 min和40 min时,不同剂量rCARDS Mp毒素组细胞IL-1βmRNA水平变化不明显,rCARDS Mp毒素作用1 h^3 h时,各组细胞IL-1βmRNA和ROS水平显著增加并呈剂量依赖性。结论CARDS肺炎支原体毒素可以激活THP-1细胞NLRP3炎性体活化并诱导细胞自噬。

雌激素在煤焦沥青烟致小鼠肺癌模型建立过程中的作用研究

目的建立以煤焦沥青(CTP)烟提取物灌胃诱发雌性KM小鼠肺癌的动物模型,并以雌二醇(E2)为代表,研究雌激素在该CTP致小鼠肺癌模型过程中的作用。方法将260只5周龄清洁级雌性KM小鼠按随机原则分为9组,分别为CTP组(27只)、CTP+E2组(28只)、CTP+TAM组(29只)、CTP+E2+TAM组(28只)、E2组(34只)、TAM组(30只)、E2+TAM组(29只)、溶剂对照组(27只)、空白对照组(28只),每组分别给予不同的染毒处理,观察并记录小鼠的生长、活动、饮食和健康状况,并称量体重。染毒后10周处死,收集各组肺组织,HE染色后,显微镜观察组织病理变化情况;观察肿瘤发生数,计算肺癌发生率。结果CTP+E2+TAM组小鼠肺癌发病率为32.14%,其肺癌发病率和肿瘤数均低于CTP+E2组,差异无统计学意义(P>0.05);CTP组小鼠肺癌发病率为26.92%,其肺癌发病率和肿瘤数均高于溶剂对照组和空白对照组(P<0.05);CTP+E2组的肺癌发病率最高,为57.14%,其肺癌发病率和肿瘤数均高于对照组和单纯E2组(P<0.05);肿瘤结节HE染色确诊的肿瘤均为腺瘤,与正常肺组织分界清楚。肿瘤组织呈腺样排列,主要位于核膜下。结论建立了CTP烟提取物诱发雌性KM小鼠肺癌的动物模型,E2能够促进CTP烟提取物诱发的小鼠肺癌。