重组人肠三叶因子减轻烧伤后肠源性高代谢的实验研究

目的探讨重组人肠三叶因子(rhITF)对烧伤后肠源性高代谢的作用及期机制。方法采用30%体表面积Ⅲ度烧伤小鼠模型,将72只BALB/c小鼠随机分为正常对照组(C组,8只)、烧伤对照组(B组,每个时相点8只)和rhITF治疗组(ITF组,每个时相点8只)。观察伤前及烧伤后1、3、5、7d小鼠静息能量代谢率(REE)的变化,同时检测伤后血浆内毒素(LPS)、肿瘤坏死因子α(TNFα)、白细胞介素-1(IL-1)和白细胞介素-6(IL-6)的含量。结果两组烧伤小鼠的REE、TNFα、LPS、IL-1和IL-6水平均明显高于烧伤前水平(P<0.05),两组比较,ITF组小鼠REE明显低于B组,平均降幅达25%左右。与之对应,血浆LPS、TNF-α、IL-1和IL-6含量也明显低于B组(P<0.05)。结论 rhITF能减轻烧伤后肠道受损程度,降低烧伤小鼠血中炎症介质水平,从而减轻烧伤后肠源性高代谢。

不同途径给予重组人肠三叶因子对烧伤后小鼠肠黏膜屏障功能的影响

目的探讨重组人小肠三叶因子(rhITF)对烧伤后肠黏膜屏障功能的影响。方法建立30%体表面积Ⅲ度烧伤小鼠模型,将104只BALB/c小鼠随机分为正常对照组(C组,n=8)、烧伤对照组(B组,n=32)、肠三叶因子灌胃给药组(IG组,n=32)和rhITF皮下注射组(SC组,n=32)。观察伤前及烧伤后1、3、5、7d小鼠肠黏膜屏障功能的变化及不同途径给予rhITF对其的影响。结果烧伤后肠黏膜损伤指数、通透性、血浆二胺氧化酶(DAO)活性明显高于C组,而肠上皮细胞增殖指数和肠黏膜厚度则显著降低。与B组比较,IG组和SC组小鼠的损伤指数、通透性和DAO活性明显降低(P<0.05),黏膜厚度显著增加(P<0.05)。与SC组比较,IG组的疗效更明显(P<0.05)。结论 rhITF能有效减轻烧伤后肠道损伤,维护肠黏膜屏障功能,通过胃肠途径给予肠三叶因子的疗效更佳。

含hITF启动子的荧光素酶报告质粒的构建及活性检测

目的构建含有人肠三叶因子(intestinal trefoil factor,hITF)启动子的荧光素酶表达载体,并检测启动子活性。方法采用PCR技术从LS-174T细胞基因组DNA中扩增出长约2.5kb的含hITF基因启动子片段(-2331/+53),而后在此基础上构建了10个不同长度的启动子序列至pGL-3basic荧光素酶表达载体,然后将这些重组质粒转染HEK-293细胞并在48h后检测其荧光素酶活性。结果插入的hITF启动子片段测序结果显示正确,-500/+53,-400/+53和-300/+53片段活性介于0.023～0.026之间,-200/+53,-100/+53和-50/+53活性介于0.0032～0.0042之间,明确了最小活性功能域位于-300/+53区域,-300/-200区域对hITF转录起始起关键性作用。结论成功构建了含hITF启动子的萤火虫荧光素酶报告基因质粒,鉴定出人肠三叶因子(hITF)启动子活性位于-300/-200区域。

肠三叶因子和黏蛋白对烧伤血清所致肠上皮细胞免疫功能变化的影响

目的观察肠三叶因子（ITF）和黏蛋白对烧伤血清所致肠上皮细胞免疫功能变化的影响。方法（1）体外培养大鼠小肠上皮细胞株IEC-6，根据培养液添加物质不同，按照随机数字表法将细胞分为5组：①正常对照组，培养液中含10％（指体积分数，下同）小牛血清；②烧伤对照组，培养液含10％烧伤血清；③ITF＋烧伤血清组，培养液含10％烧伤血清及终浓度25ug／mLITF；④黏蛋白＋烧伤血清组，培养液含10％烧伤血清及终浓度250ug／mL黏蛋白；⑤ITF＋黏蛋白＋烧伤血清组，培养液含10％烧伤血清及终浓度25ug／mLITF、250ug／mL黏蛋白。向各组细胞加入上述培养液的同时，加入大肠杆菌菌液（1×10^8CFU／mL，200uL）。继续培养15min、30min、1h、2h、3h后，行瑞氏-吉姆萨染色，于显微镜下观察并统计黏附在细胞上的细菌数；采用锥虫蓝染色法观察并统计细胞存活率。每组每时相点样本数均为20。（2）将IEC-6细胞按照随机数字表法分为4组：烧伤对照组、ITF＋烧伤血清组、黏蛋白＋烧伤血清组、ITF＋黏蛋白＋烧伤血清组，分别同前加入相应的培养液（不加菌液）培养3、6、12、24、48h。采用放射免疫分析法测定各时相点培养上清液中TNF-a、IL-6和IL-8含量，每组每时相点样本数均为6。对实验数据行t检验。结果（1）烧伤对照组细胞各时相点细菌黏附数量较正常对照组明显增多（t值为2．947～8．149，P值均小于0．01）。与烧伤对照组比较，其余3个烧伤血清组在加菌后多数时相点细菌黏附的数量明显偏少（t值为-4．733～-2．180，P〈0．05或P〈0．01）。烧伤对照组细胞各时相点存活率与正常对照组比较均明显降低（t值为-4．126～-2．363，P值均小于0．05）。ITF＋烧伤血清组、黏蛋白＋烧伤血清组细胞存活率在部分时相点明显高于烧伤对照组（t值为2．120～3．423，P〈0．05或P〈0．01）。ITF＋黏蛋白＋烧伤血清组细胞存活率加菌后15min为（96．7±2．4）％，明显高于ITF＋烧伤血清组[（94．5±3．1）％，t=2．507，P〈0．05]；在3h时为（84．0±6．7）％，明显高于黏蛋白＋烧伤血清组[（77．1±8．2）％，t=2．934，P〈0．01]。（2）ITF＋黏蛋白＋烧伤血清组培养6、12、24、48h，TNF—a含量均低于其余3组（t值为-6．914～-2．889，P〈0．05或P〈0．01）。ITF＋黏蛋白＋烧伤血清组IL-6含量在部分时相点明显低于其余3组（t值为-7．657～-2．580，P〈0．05或P〈0．01）。ITF＋黏蛋白＋烧伤血清组在培养6、12、24、48hIL-8含量明显低于烧伤对照组和黏蛋白＋烧伤血清组（t值为-8．802～-3．640，P值均小于0．01）；在培养12、24h明显低于ITF＋烧伤血清组（t值分别为-2．786、-2．740，P值均小于0．05）。结论ITF能维护肠上皮细胞功能，抵御细菌黏附，降低细胞死亡率，同时能维护细胞免疫稳态，减少炎症介质释放；ITF与黏蛋白联用效果更明显。

肠三叶因子和黏蛋白对烧伤血清所致肠上皮细胞增殖移行能力变化的影响

目的观察烧伤血清所致肠上皮细胞增殖、移行能力的变化，以及联合应用肠三叶因子（ITF）和黏蛋白对其的影响。方法将大鼠小肠上皮细胞株IEC-6传代培养，按照随机数字表法分为正常对照组、烧伤血清组、ITF＋烧伤血清组、黏蛋白＋烧伤血清组和ITF＋黏蛋白＋烧伤血清组，均采用DMEM培养液培养，其内分别添加体积分数10％小牛血清、体积分数10％烧伤大鼠血清、25ug／mLITF和体积分数10％烧伤大鼠血清、250ug／mL黏蛋白和体积分数10％烧伤大鼠血清以及联合使用上述剂量ITF、黏蛋白和烧伤大鼠血清。处理后0～4d观察细胞增殖能力；划痕实验后12、24、36、48、72h观察细胞移行情况；Transwell法（细胞置于上室、培养液加入下室）培养4、6、8、10、12h，观察细胞变形能力，以下室内细胞计数表示。对数据进行t检验。结果（1）细胞增殖能力。处理后1～4d烧伤血清组细胞数量明显低于正常对照组（t值为-16．569～-2．613，P〈0．05或P〈0．01）。ITF＋烧伤血清组和黏蛋白＋烧伤血清组细胞数量与烧伤血清组接近（t值分别为0．037～0．740、0．116～0．429，P值均大于0．05）；处理后2d，ITF＋黏蛋白＋烧伤血清组细胞数量明显高于烧伤血清组（t=6．484，P〈0．01）、ITF＋烧伤血清组（t=3．838，P〈0．01）。（2）细胞移行能力。烧伤血清组划痕后各时相点细胞移行距离均远远短于正常对照组（t值为-37．594～-6．727，P值均小于0．01）。与烧伤血清组比较，黏蛋白＋烧伤血清组划痕后各时相点细胞移行距离无明显变化（t值为0．055—0．589，P值均大于0．05）。ITF＋烧伤血清组划痕后12、24、36h细胞移行距离分别为（47±6）、（126±13）、（170±11）um，明显长于烧伤血清组[（42±7）、（98±14）、（154±22）um，t值为2．230～4．817，P〈0．05或P〈0．01]。ITF＋黏蛋白＋烧伤血清组划痕后各时相点细胞移行距离明显长于烧伤血清组（t值为2．982—7．390，P〈0．05或P〈0．01），划痕后12～48h明显长于ITF＋烧伤血清组（t值为2．707～2．918，P〈0．05或P〈0．01）。（3）细胞变形能力。与正常对照组比较，烧伤血清组穿孔细胞数大幅减少（t值为-23．965～-6．436，P值均小于0．01）。与烧伤血清组比较，黏蛋白＋烧伤血清组各时相点穿孔细胞数改变不明显（t值为0．199～0．797，P值均大于0．05）；ITF＋烧伤血清组各时相点穿孔细胞数均明显增加（t值为3．650～10．028，P值均小于0．01）。ITF＋黏蛋白＋烧伤血清组各时相点穿孔细胞数明显多于烧伤血清组（t值为4．313～15．100，P值均小于0．01），培养10、12h时穿孔细胞数分别为（328±47）、（465±37）个，明显多于ITF＋烧伤血清组[（277±25）、（353±34）个，t值分别为3．051、6．945，P值均小于0．01]。结论ITF对肠上皮细胞增殖影响有限，但能明显改善细胞变形能力，促进细胞移行；单独使用黏蛋白对细胞无明显作用，与ITF联合应用能增强ITF的作用。ITF维护肠黏膜屏障的主要机制为促进细胞移行。