毕赤酵母电转化方法的探索

旨在通过优化转化条件提高毕赤酵母电转化效率。采用不同的酵母细胞预处理液成分及浓度、不同的细胞体积、不同的质粒DNA用量,在不同的电压下进行转化,计数转化后在平板上产生的克隆数,通过计算每微克DNA获得的克隆数来评价转化效率。研究表明,用0.1 mol/L LiAc,0.01 mol/L DTT,0.6 mol/L sorbitol,0.01 mol/L Tris-HCl处理细胞可获得最佳转化效率;质粒DNA用量为10 ng时转化效率最高。使用0.1 cm电转杯,采用0.6 kV电压,对80μL细胞进行转化,转化效率最高,可达9.6×105/μg DNA;而使用0.2 cm电转杯,采用1.1 kV电压,对150μL细胞进行转化,转化效率最高,可达8.8×105/μg DNA。采用优化后条件,用10μg pPIC9K质粒DNA转化GS115,可获得1.1×106个转化子。此外通过对3种常用毕赤酵母载体转化效率的比较,发现pPIC9K的转化效率约是pPICZαA的160倍,是pGAPZαA的2 900倍。采用优化后的转化条件,毕赤酵母的电转化效率从103-4提升到了106。采用单个电转杯最多可获得1.1×106个转化子。

靶向人表皮生长因子受体3的人源Fab抗体构建及鉴定

目的:制备靶向人表皮生长因子受体3(HER3)的全人源Fab型抗体,并对其亲和力及生物学活性进行鉴定。方法:用Bsp QⅠ限制性内切酶分别将靶向HER3的全人源抗体的完整轻链、重链的可变区全长和CH1恒定区插入载体p3457,构建重组质粒;通过将轻、重链质粒瞬时共转染293E悬浮细胞进行表达,并利用镍柱纯化得到Fab型抗体蛋白;采用ELISA鉴定其与HER3胞外区是否结合,Forte Bio实验鉴定其亲和力,CCK8检测其对MDA-MB-453细胞增殖能力的影响。结果:分别获得表达轻链全长、重链可变区全长及CH1恒定区的HER3抗体重组质粒,并通过瞬时共转染293E悬浮细胞获得分泌型HER3 Fab抗体;ELISA实验证明其可与HER3胞外区蛋白直接结合;Forte Bio实验证明Fab型抗体与人源HER3胞外区蛋白具有一定的亲和力(KD=1.08×10-8mol/L);体外增殖实验表明,该抗体可显著抑制MDA-MB-453体外增殖。结论:通过293E悬浮细胞表达、镍柱亲和纯化,获得具有较高亲和力和功能活性的HER3 Fab型抗体,为HER3高表达型癌症的诊断、治疗提供物质基础。

不同肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白N-糖基化修饰糖链的初步分析

目的建立基于LC-MS的N-糖基化修饰糖链的分析方法,并比较不同肿瘤坏死因子受体(TNFR)-Fc融合蛋白N-糖基化修饰差异。方法用肽-N-糖苷酶F释放糖蛋白中的修饰糖链,有机溶剂沉淀蛋白后,利用还原胺化反应将2-氨基苯甲酰胺标记至糖链上,并通过亲水作用萃取柱除去过量标记试剂,所得糖链采用ZIC-HILIC亲水作用色谱柱结合离子阱质谱进行分析。以市售TNFR-Fc融合蛋白为标准品,优化影响标记效率的各种因素后,对A和B两种TNFR-Fc融合蛋白制品的N-糖基化修饰糖链进行了分析和比较。结果 TNFR-Fc融合蛋白A和B中的修饰糖链主要含有岩藻糖、末端唾液酸、末端半乳糖、末端N-乙酰葡糖胺等糖型,且末端唾液酸含量相近,但融合蛋白A的岩藻糖和末端N-乙酰基葡萄糖的含量显著高于融合蛋白B,而融合蛋白B末端半乳糖含量高于融合蛋白A。结论成功建立了基于LC-MS的N-糖基化修饰糖链的分析方法,该方法可有效分析糖蛋白中的修饰糖链类型和含量比例,对于详细表征糖蛋白药物结构及性质具有参考价值,并为进一步研究糖基化对糖蛋白药物药理活性以及药代动力学研究奠定了良好基础。

人源抗BLyS单链抗体的筛选及其构建与表达

目的:从人源单链抗体库中筛选抗B细胞刺激因子(BLy S)的单链抗体基因、构建表达载体并实现单链抗体的表达。方法:以哺乳动物细胞展示型人源Sc Fv抗体库为起始文库,通过流式细胞术进行分选,获得荧光强度最强、比例为0.1%的阳性细胞。从候选细胞中提取质粒并转化至DH5α中进行扩增,得到质粒转染293T细胞作为下一轮筛选所需的抗体库。经过依次降低抗原浓度进行了3轮分选得到2个候选的Sc Fv序列。经序列分析,选择其中一种单链抗体基因,利用基因工程技术构建分泌型表达质粒,转染293E细胞并通过镍亲和层析纯化获得B-10 Sc Fv抗体蛋白并通过Fortie Bio Octet QK进行亲和力分析。结果:经过3轮筛选获得了全新的抗BLy S Sc Fv抗体序列,成功构建并表达了anti-Bly S Sc Fv抗体蛋白,该单链抗体与的BLy S亲和常数为3.08 nmol·L-1。结论:从哺乳动物细胞展示型人源Sc Fv抗体库中成功获得了可结合BLy S的全新单链抗体基因序列,该单链抗体与BLy S具有较高的亲和力,这为后续的活性研究以及产品开发奠定了基础。