人成纤维细胞生长因子-21基因的克隆表达及蛋白的纯化

目的:构建和表达人成纤维细胞生长因子-21(FGF21)的基因工程菌,为治疗2型糖尿病的新药开发提供实验数据。方法:通过PCR方法,以质粒pET20b-FGF21为模板扩增FGF21全长,将其与分子伴侣SUMO相融合,再将该融合基因与原核表达载体pET20b连接后转化至BL21(Rosetta)宿主细胞中,通过IPTG诱导获得可溶性表达。将融合蛋白经Ni-NTA、分子筛等进行纯化,获得的蛋白纯度在95%以上。结果:经酶切和基因测序证实获得的FGF21基因序列与GenBank(登录号NM019113)报道的完全一致,构建的pET20b-SUMO-FGF21表达载体在BL21大肠杆菌中成功表达FGF21蛋白,蛋白表达量在15%以上,经SDS-PAGE证实其相对分子质量为19401,与理论预期值相符。Western blotting分析该表达产物与人FGF21多克隆抗体具有特异性结合能力,经SUMO酶酶切后获得纯度大于95%以上的纯蛋白。结论:成功构建表达人FGF21融合蛋白的基因工程菌,经IPTG诱导、Ni-NTA、分子筛等进行纯化后获得了FGF21纯蛋白。

甘草中黄酮类抗氧化成分的提取工艺研究

目的探讨甘草黄酮类抗氧化成分的最佳提取工艺。方法经L9(34)正交试验研究黄酮有效部位的最佳提取工艺,对提取部位的抗氧化活性条件筛选。结果最佳工艺为:9 0%乙醇提取,1∶1 2的加液量,加热回流3次每次1.5 h。结论本实验确定的最佳提取工艺简便可行。

重组人成纤维细胞生长因子-21的表达及纯化工艺的优化

目的优化重组人成纤维细胞生长因子-21(SUMO-rhFGF-21)融合表达工程菌的表达条件及目的蛋白纯化工艺。方法对工程菌的诱导温度、时间及诱导剂浓度进行优化,并进行罐发酵,对菌体裂解液进行离子交换层析、Ni离子亲和层析及分子筛层析等。纯化产物经SDS-PAGE和HPLC鉴定纯度。结果在诱导温度为37℃,诱导时间为4h,IPTG浓度为0.5mmol/L时,目的蛋白的表达量最高,达20.5%;罐发酵收菌量可达66g/L,目的蛋白的表达量达20.2%;纯化后的rhFGF-21纯度达96%以上。结论优化了rhFGF-21的表达条件及纯化工艺,为rhFGF-21用于新药开发奠定了基础。