脂多糖抑制小鼠肺成纤维细胞自噬的观察性研究

目的观察体外原代培养的小鼠肺成纤维细胞在脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)作用下,自噬微管相关蛋白轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,MAP1LC3)(以下简称LC3)和Beclin-1的表达情况,以明确LPS对肺成纤维细胞自噬的调控作用.方法将培养至4~7代的小鼠肺成纤维细胞接种于6孔培养板,密度1×10^4个/ml.待细胞贴壁后,更换无血清培养基饥饿过夜,采用随机数字表法将其分为4组(每组3孔):PBS对照组(Con组)、250μg/L LPS组(LPS250组)、500μg/L LPS组(LPS500组)、1 000μg/L LPS组(LPS1 000组),除Con组外,其余组分别加入以上终浓度LPS,各组在加入PBS或LPS后30 h裂解细胞并提取总蛋白,通过Western blot法比较小鼠肺成纤维细胞经不同浓度LPS刺激后LC3和Beclin-1蛋白的表达情况;同时,采用随机数字表法将传代细胞分为2组(每组3孔):IF-Con组(加入PBS作为对照)和IF-LPS组(加入1 000μg/L的LPS),采用免疫荧光技术比较IF-Con组和IF-LPS组中小鼠肺成纤维细胞内自噬小体的表达情况.结果随着LPS刺激浓度的增高,LC3蛋白表达量下调,而LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ在Con组最高,随LPS刺激浓度的升高逐渐降低,LPS1 000组中,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ较Con组降低(P<0.05);Beclin-1蛋白的表达量在Con组、LPS250组和LPS500组间差异无统计学意义(P>0.05),而在LPS1 000组中,Beclin-1蛋白表达较Con组明显下调(P<0.05).同时,免疫荧光实验结果显示IF-LPS组中小鼠肺成纤维细胞内自噬小体的表达量较IF-Con组明显降低.结论在体外培养的小鼠肺成纤维细胞中应用1 000μg/L的LPS可以下调LC3和Beclin-1的蛋白表达,并抑制自噬小体的形成,表明LPS可以抑制肺成纤维细胞的自噬.提示LPS抑制肺成纤维细胞的自噬可能是肺纤维化发生的机制之一.

脂多糖对肺成纤维细胞胸腺细胞分化抗原-1及整合素β3表达的调控并抑制自噬的研究

目的 明确脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）对小鼠肺成纤维细胞胸腺细胞分化抗原-1（thymocyte differentiation antigen-1, Thy-1）和整合素β3蛋白表达的调控作用，并观察其与肺成纤维细胞自噬抑制的关系。 方法 将原代培养的小鼠肺成纤维细胞采用随机数字法分为4组（每组3孔）：PBS对照组（Con组）、0.25 mg/L LPS组（LPS0.25组）、0.50 mg/L LPS组（LPS0.50组）、1.00 mg/L LPS组（LPS1.00组），随后以不同浓度LPS（0.25、0.50、1.00 mg/L）刺激，于刺激后6 h通过Western blot检测不同浓度LPS刺激小鼠肺成纤维细胞后Thy-1和整合素β3蛋白的表达情况。于刺激后30 h比较肺成纤维细胞自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/Ⅰ和Beclin-1的表达情况，同时通过透射电子显微镜观察细胞内自噬小体形成情况。 结果 随着LPS刺激浓度的增加，小鼠肺成纤维细胞的Thy-1蛋白表达量下降，其中LPS1.00组较Con组有明显下降（P〈0.05）；整合素β3蛋白表达量升高，其中LPS1.00组较Con组有明显升高（P〈0.05）。LPS1.00组刺激小鼠肺成纤维细胞30 h后明显抑制其自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/Ⅰ和Beclin-1的表达（P〈0.05），并抑制自噬小体形成（P〈0.05）。 结论 LPS可下调Thy？蛳1蛋白表达、上调整合素β3蛋白表达，同时抑制自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/Ⅰ和Beclin-1的表达及自噬小体的生成，该过程可能与LPS诱导肺成纤维细胞自噬抑制以及肺纤维化进展有关。

脂多糖诱导内源性高迁移率族蛋白B1分泌活化核因子-κB通路促进肺成纤维细胞异常增殖

目的观察脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)刺激小鼠原代培养肺成纤维细胞后内源性高迁移率族蛋白B1(high mobility group box-1 protein, HMGB1)细胞内移位及细胞外分泌的情况,并明确其在LPS诱导肺成纤维细胞异常增殖过程中的重要作用。 方法①将原代培养的小鼠肺成纤维细胞采用随机数字表法分为2组(每组3个孔),即PBS对照组(Con组)和LPS组(100 μg/L),Western blot检测LPS刺激12 h后HMGB1乙酰化修饰的情况,同时采用免疫荧光检测HMGB1细胞内的定位情况。②将原代培养的小鼠肺成纤维细胞采用随机数字表法分为4组(每组3个孔),即PBS对照组(Con组)、100 μg/L LPS组(LPS100组)、250 μg/L LPS 组(LPS250组)和500 μg/L LPS(LPS500组),于LPS刺激24 h后采用ELISA法检测上清液中HMGB1的含量。③采用随机数字表法将小鼠原代肺成纤维细胞分为4组(每组6个孔),NF-κB通路抑制剂吡咯烷二硫代甲酸铵(ammonium pyrrolidinedithiocarbamate, PDTC)预处理细胞30 min后再分别使用LPS、HMGB1刺激细胞0、12、24 h和48 h,即PBS对照组(Con组)、 LPS组(或HMGB1组)、PDTC组、LPS+PDTC组(或HMGB1+PDTC组),Cell Counting Kit-8(CCK-8)实验检测细胞增殖情况。 结果①与Con组比较,LPS刺激细胞12 h后,LPS组乙酰化HMGB1/总HMGB1明显升高(P<0.05),同时细胞质中HMGB1表达明显增加。② LPS刺激细胞24 h后,LPS各组上清液中HMGB1含量较Con组明显升高(P<0.05)。③ LPS刺激细胞24 h和48 h 后,PDTC+LPS组细胞的光密度(D)值较LPS组明显降低(P<0.05);HMGB1刺激细胞12、24 h和48 h后,PDTC+HMGB1组D值较HMGB1组均明显降低(P<0.05)。 结论LPS可促进小鼠肺成纤维细胞核内HMGB1的主动分泌,进而通过活化NF-κB信号通路加速细胞增殖,可能是LPS诱导肺成纤维细胞异常增殖的重要机制。

PFKFB3参与脂多糖诱导肺成纤维细胞及肺组织有氧糖酵解的观察性研究

目的:观察脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导肺成纤维细胞及肺组织有氧糖酵解关键酶6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶3(6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-biphosphatase 3,PFKFB3)表达及其与有氧糖酵解的关系,探讨在LPS诱导肺纤维化过程中肺成纤维细胞和肺组织有氧糖酵解的潜在机制。方法:将人胚肺成纤维细胞MRC-5细胞系采用随机数字表法分为PBS对照组(PBS组)和LPS组(每组3孔),Western blot检测LPS刺激细胞6h后PFKFB3表达情况,同时免疫荧光显示PFKFB3在细胞内的定位情况;于LPS刺激后48 h采用海马细胞能量代谢仪检测细胞耗氧率(oxygen consumption rate,OCR)和产酸率(extracellular acidification rate,ECAR),并采用比色法检测有氧糖酵解产物乳酸产生情况,同时Western blot检测LPS刺激48 h后Ⅰ型胶原蛋白合成情况。将24只C57BL/6小鼠按随机数字表法分为生理盐水对照组(C组)、LPS组(L组),每组12只,L组、C组连续5d分别腹腔注射5 mg/kg LPS、等容量生理盐水;每组各6只于造模后第7天无痛处死小鼠,取血浆和肺组织,Western blot和免疫荧光检测各组肺组织中PFKFB3表达情况,比色法检测各组小鼠血浆中乳酸的含量;剩余小鼠于造模后第28天取肺组织,一侧肺通过Western blot检测肺组织Ⅰ型胶原蛋白合成情况,另一侧肺做石蜡切片进行病理学检测。结果:与PBS组比较,LPS刺激细胞6h后PFKFB3表达明显升高(P<0.05);LPS刺激细胞48 h后,与PBS组比较,LPS组细胞耗氧率降低、产酸率增加,代谢产物乳酸含量明显升高(P<0.05),同时细胞Ⅰ型胶原蛋白合成显著增加(P<0.05)。与C组比较,L组小鼠腹腔注射LPS 7 d后肺组织中PFKFB3表达明显升高(P<0.05),血浆乳酸含量明显升高(P<0.05);LPS注射28 d后,L组小鼠Ⅰ型胶原蛋白表达明显升高(P<0.05),肺组织出现明显纤维化。结论:在LPS诱导的肺纤维化过程中,LPS可诱导肺成纤维细胞和肺组织中PFKFB3蛋白表达,该过程与其有氧糖酵解过程相关,PFKFB3的表达上调可能是LPS诱导肺成纤维细胞和肺组织有氧糖酵解和肺纤维化的关键环节。