纳米孔基因测序技术在HLA基因分型中的应用

人类白细胞抗原(Human leukocyte antigen,HLA)基因是人类基因组中最复杂的基因区域,主要参与机体免疫反应,HLA的基因分型在器官移植以及疾病诊疗等领域有着广泛的临床应用。现有的HLA分型方法在临床实践中发挥了重要作用,但也存在一些技术限制和局限性。纳米孔基因测序技术的出现为快速鉴定HLA基因分型提供了全新视角。该技术以其快速、实时测序和长读长等特点,为复杂的HLA区域提供了更为快速精确的识别能力。该技术不仅能更快速地解析HLA基因型,还对前沿高通量基因测序新技术开发HLA分型方法的研究具有潜在的借鉴意义。本文主要对纳米孔基因测序技术在HLA分型领域中的研究方法和临床应用进行综述。

猪繁殖与呼吸综合症病毒江西株的分离与鉴定

试验从江西省爆发疑似PRRS临床症状的某猪场病猪血清中分离到一株致Marc - 14 5细胞病变的病毒。负染电镜观察结果可见直径约 5 0nm大小的有囊膜的球形病毒粒子 ;超薄切片可见胞浆内有大量直径约 4 0～ 80nm球形或椭圆形病毒粒子。间接免疫荧光试验结果表明该分离株与美洲型PRRS阳性血清反应发出强特异性荧光 ,而与欧洲型阳性血清只出现弱的荧光效应 ,初步鉴定该分离株为美洲型PRRS病毒 。

猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白基因的克隆与原核表达研究

采用RT-PCR方法自猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组分离出核衣壳蛋白基因(orf 7),克隆到pMD18-T载体构建成重组质粒pMD18N并进行测序比较,结果表明,所克隆的核衣壳蛋白基因序列与PRRSV美洲型ATCC VR-2332株的同源性为100%,表明orf 7 是PRRSV基因组内很保守的序列;将orf 7亚克隆到原核表达载体pGEX-KG,构建成重组质粒pGEX-KGN,用pGEX-KGN转化表达菌株BL21,经SDS-PAGE和 Western-blot分析表明:克隆在谷胱苷肽转移酶(Glutathione S-transferase(GST)下游的核衣壳蛋白基因与GST获得了高效融合表达,表达的融合蛋白GST-N分子量约为41kDa,并且有免疫学反应活性;这为猪繁殖与呼吸综合征的血清学诊断方法的建立打下了基础。

线粒体损伤相关模式分子与宿主免疫调节

线粒体是真核细胞至关重要的细胞器,参与机体细胞能量代谢和细胞凋亡等多种生物学过程。线粒体还参与机体的天然免疫反应的调节。线粒体不仅可以作为病毒免疫反应的载体,还可以通过产生ROS参与抗菌反应。线粒体受到损伤、刺激后,可释放mt DNA,TFAM,ROS,ATP,心磷脂和甲酰肽等内容物。这些分子可以作为损伤相关模式分子(damage-associated molecular patterns,DAMPs)被模式识别受体识别,从而参与宿主的免疫调节。研究表明,线粒体已成为内源性DAMPs的重要来源,在先天性免疫应答以及疾病进展过程中发挥着重要的作用。本文就线粒体来源的损伤相关模式分子在机体免疫调节中的作用进行综述。

大蒜素的研究状况

大蒜素是近年发展起来的一种多功能添加剂,以其作用广泛、效果显著、无残留、无抗药性、无致变致畸致癌性、低成本和具调味等优点而倍受养殖户和饲料厂家的青睐.当前饲料工业中使用的大蒜素一般是人工合成的大蒜油为原料的预混料(大蒜油吸附在一定的载体上形成的预混料),呈白色流动性的细小粉末.而天然大蒜油存在于大蒜中,须经过提取才能得到.

数字PCR及其在现代医学分子诊断中的应用

数字PCR(digital PCR,d PCR)技术被认为是精确定量核酸分子的全新技术手段,因为具有较高的灵敏度和特异性等特点而得到迅速发展。数字PCR在临床上的多个领域展现出良好的应用前景,比如肿瘤液体活检、器官移植物损伤评估、无创产前筛查、病原微生物分子诊断以及二代测序文库质控和结果验证等。本文就数字PCR在上述领域中的应用研究及其进展进行综述。

TLR9基因敲除小鼠的构建及表型初步鉴定

目的构建TLR9基因敲除小鼠模型,并对其表型进行初步鉴定。方法利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建TLR9基因敲除小鼠;利用毛细管凝胶电泳技术鉴定敲除小鼠的基因型,并通过PCR产物测序分析对敲除效果进行鉴定;利用qRT-PCR和Western blot及免疫组织化学技术分别检测TLR9基因在mRNA水平和蛋白质水平的表达情况;观察基因敲除小鼠的遗传性状、体重及血常规变化;并通过苏木精-伊红(HE)染色观察小鼠组织的病理形态学变化。结果PCR和测序结果表明TLR9基因敲除成功。敲除小鼠的脾、肝组织中TLR9基因mRNA及蛋白质水平表达显著低于野生型小鼠;TLR9基因敲除小鼠可正常生长繁殖,体重、外周血血常规各项指标均正常。TLR9基因敲除小鼠各组织形态学特征与野生型小鼠相比无明显差异。结论成功建立TLR9基因敲除小鼠模型,为研究TLR9基因的生物学功能和调控机制提供实验动物模型。

Toll样受体9在肿瘤发生发展中的研究进展

Toll样受体9(toll-like receptor 9,TLR9)作为先天性免疫系统中参与识别病原相关分子模式(pathogen associated molecular patterns,PAMPs)的一种受体,是近年来肿瘤免疫学的研究热点之一。TLR9在多种肿瘤细胞中表达,其信号转导通路的激活在促进炎症和肿瘤形成过程中起重要作用。研究表明,TLR9可通过促进肿瘤微环境形成,参与肿瘤细胞的增殖及免疫逃逸等,从而促进肿瘤的发生发展,已成为肿瘤靶向治疗的重要靶点。本文就TLR9与肿瘤发生发展及治疗的研究进展进行综述。

鸭疫里氏杆菌江西分离株的微生物学特性

对从江西省部分鸭场分离的17株鸭疫里氏杆菌微生物学特性进行了研究。生理生化试验的结果为:17个菌株对尿素酶和过氧化氢酶均为阳性,7个菌株能液化明胶,8个菌株氧化酶阳性,所做药敏试验的13个菌株均对红霉素、氯霉素高度敏感。随机取4个菌株人工感染11日龄雏鸭,发病率均为100%,死亡率33%～100%。

循环肿瘤细胞检测技术进展及其临床应用

循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTCs)是从原发性肿瘤或其转移瘤脱落释放在外周血循环中的癌细胞。CTCs在肿瘤转移和扩散中起着至关重要的作用。CTCs的检测是一种非侵入性诊断方法,即液体活检。CTCs的检测和分析可用于癌症的早期筛查、疗效评估和预后的判断,并且可以实时监测癌症的进展,已成为近年来癌症领域的研究热点。本文综述了CTCs检测技术和相关临床应用研究进展。

基于长读长高通量基因测序技术在肿瘤融合基因检测中的应用进展

染色体易位能导致融合基因产生,已有研究证明融合基因是多种癌症发生的重要驱动因素,是临床诊断、治疗以及预后的潜在靶点。因此,鉴定融合基因具有重要的临床价值。目前临床常用的检测手段包括Sanger、RT-PCR、FISH等,不仅耗时长,而且仅能检测已知的融合基因。第二代测序技术(Second generation sequencing,SGS)凭借其高通量的特性,成为遗传学常规诊断工具,但短读长和价格昂贵等缺点限制了其在染色体结构变异检测方面的应用范围。第三代基因测序技术(Third generation sequencing,TGS)凭借其高通量、长读长、价格便宜的优点,为融合基因检测带来了新的曙光。本文简单介绍了肿瘤融合基因的产生和相关检测手段,重点探讨长读长高通量基因测序技术在肿瘤融合基因检测中的应用。

高通量基因测序技术在新型冠状病毒检测中的应用

2019年12月份起,不明原因的肺炎患者造成中国武汉疫情大暴发。通过对肺炎患者样本分析,发现了一种新型冠状病毒,目前被世界卫生组织命名为2019-nCoV。高通量测序技术的发展促进了对微生物病原的快速分析能力,当前暴发的新型冠状病毒的首次发现便是基于宏基因组高通量二代测序技术所实现的。本文就二代测序(NGS)和第三代纳米孔测序等高通量基因测序技术在新型冠状病毒中的应用进行简要阐述。

循环肿瘤DNA在肿瘤液体活检中的应用及临床意义

肿瘤是全球死亡的主要原因之一。准确评估肿瘤的内在分子特点对于采取临床有效的治疗方法至关重要,分子诊断技术的进步有助于揭示肿瘤的内在特性。新兴的证据表明,液体活检在肿瘤的临床应用上具有相当大的潜力。循环肿瘤DNA(Circulating tumor DNA,ctDNA)是液体活检的主要内容之一,其可以反映肿瘤的内在分子特征,并可实时监测肿瘤基因组的动态变化,对个体化临床用药具有重要的临床指导意义。本文对ctDNA在临床应用的关键领域及其重要意义,包括肿瘤负担的评判、突变的检测、个性化治疗的选择,治疗的监测、预后的判断等进行综述。

基于Cas9靶向富集的纳米孔高通量基因测序技术的应用进展

高通量测序已逐渐成为医学与生命科学领域的一种重要技术方法,但全基因组序列分析的复杂性和测序的高成本仍是目前高通量测序的障碍。靶向测序是一种捕获基因组特定区域DNA并进行高深度测序的方法,它在遗传性疾病、癌症测序和精准医学等方面具有广泛应用。目前常见的靶向富集方法主要有杂交捕获法和多重PCR扩增法。杂交捕获法过程繁琐、成本昂贵,PCR扩增法容易受扩增效率影响导致靶序列文库丰度不均匀,且会丢失DNA序列的表观修饰信息。近年来,基于纳米孔测序平台开发了CRISPR/Cas9靶向富集高通量测序方法(nCATs),可在无需PCR扩增的条件直接对感兴趣的基因位置进行靶向测序。该方法具有直接识别碱基修饰、读长长、实时检测、速度快等优势,在基因结构性变异、突变检测和基因的甲基化修饰检测等方面展现了良好应用前景。尤其是在融合基因的检测方面,该技术通过结合生物信息学的分析工具可检测新的融合基因和断裂位点,在临床诊疗方面具有重要的指导意义。本文将对CRISPR/Cas9靶向富集纳米孔基因测序技术的基本原理和上述应用场景进行综述,并重点阐述该技术在融合基因检测方面的最新进展。

染色体碎裂化在肿瘤中的作用及其检测技术研究进展

染色体碎裂化是指在一次细胞灾难性事件当中,染色体片段被全部打碎,然后这些片段以另一种顺序重组。经过染色体碎裂化的细胞一般会死亡,仅极少数细胞幸存下来,可能是由于大规模基因组重排让细胞有转化为癌细胞的趋势。染色体碎裂化导致的后果包括癌基因的扩增、抑癌基因的丢失以及融合基因的形成等。在染色体碎裂化的过程中,那些未参与重组的碎裂片段,一些会丢失,另一些则作为染色体外DNA(Extrachromosomal DNA,ecDNA)持续存在。这些ecDNA中的一些促进了癌细胞的生长,并能形成微小尺寸染色体,称为双微体。目前染色体碎裂化检测技术可分为常规检测技术与高通量基因测序检测技术。常规检测技术有荧光原位杂交、外周淋巴细胞核型分析和染色体微阵列技术,高通量基因测序检测技术有下一代测序技术以及长读长基因测序技术。在分析染色体碎裂化技术上,长读长基因测序技术具有更大的优势,它不仅可准确检测出染色体碎裂的断点位置,还可对破碎的片段进行定向识别与排序,检测出复杂重排位点,弥补短读长基因测序和常规检测技术上的缺陷。本文主要对染色体碎裂化在促进肿瘤进展和耐药中的作用以及当前相关检测技术的优缺点进行综述。

全长转录组测序技术解析不同转移性能肝癌细胞系的转录本表达谱与结构变异

为了更好地研究肝细胞癌的转移机制,并筛选出与肝癌预后密切相关的潜在靶点,本研究利用纳米孔长读长测序技术对两株不同转移潜能的肝癌细胞(MHCC97H与MHCC97L)进行全长转录组比较分析。通过生物信息学分析发现643个新基因(Novel gene)和2471个新转录本(New transcripts)。在这两株细胞中有293个差异表达基因及74个差异表达转录本。在结构变异分析中鉴定出1008个可变剪切事件,其中外显子跳跃占比最多。本研究通过全长转录组测序进一步完善了肝癌细胞的基因注释及基因表达分析,为揭示肝细胞癌的转移分子机制提供了新的研究思路与线索。

eccDNA的高通量基因测序技术检测方法及其作为生物标志物的临床意义

染色体外环状DNA(extrachromosomal circular DNA,eccDNA)广泛存在真核生物中,现已证实eccDNA与癌症的发生发展密切相关。电子显微镜等传统检测方法,证实了eccDNA的存在,而基于高通量基因测序技术检测eccDNA分子,不仅丰富了eccDNA的检测手段,且阐明了eccDNA的部分生物学功能和其作为生物标志物的潜在意义。本文就高通量基因测序技术在eccDNA中的应用及其作为生物标志物的临床意义进行简要阐述,并总结目前高通量基因测序技术检测eccDNA的优缺点及已知作为生物标志物的eccDNA分子特征。有望基于高通量基因测序技术进一步挖掘eccDNA未知的生物学功能及不同疾病对外周血eccDNA分子特征的影响。

游离核酸在肿瘤液体活检中的应用及临床意义

随着分子生物学技术的不断发展,以检测游离核酸作为无创分子诊断标志物的液体活检技术得以实现,且日益受到关注。与传统分子诊断技术相比,液体活检技术主要以游离核酸为检测对象,具有更全面地反映肿瘤特性、克服肿瘤异质性难题以及可以非侵入性多次取样等优点,既可以减轻患者痛苦,也提高了对肿瘤特性及其负荷评估的准确性。游离核酸无创分子标志物的研究在肿瘤早期诊断、治疗监测和预后评价等方面具有重要的临床意义。本文对游离核酸作为肿瘤液体活检标志物的临床意义及其初步应用的研究进展进行综述。