泛素化相关蛋白纯化及体外泛素化体系的建立

为构建泛素化相关蛋白的纯化方法以及利用纯化出的蛋白进行体外泛素化反应,采用分子克隆技术构建出p ET-N-His-UBE1、p ET-N-His-CDC34-C-His和p ET-N-His-UBB-CHis载体,其中p ET-N-His-UBE1载体来源于Addgene公司。将构建好的原核表达载体转化到BL21大肠杆菌中进行诱导表达,利用蛋白纯化技术纯化出相应的蛋白;将纯化出的泛素化相关的蛋白按照一定的比例混合,在ATP存在的条件下发生泛素化反应。成功建立了蛋白纯化和体外泛素化体系,即在细菌中纯化出E1、E2和泛素,在ATP存在的情况下使泛素结合到E2上。该体系的构建能为更好地探索细胞内蛋白的相互作用及人类疾病的治疗提供更多有价值的依据。

AKT1S1-pBABE重组逆转录病毒载体的构建及其稳定过表达细胞系的筛选

AKT Substrate 1 (AKT1S1)又名富含脯氨酸AKT1底物蛋白(proline-rich AKT1 substrate of 40 kDa,PRAS40)。作为经典的AKT1激酶底物,其在肿瘤生成过程中发挥着重要功能。为研究AKT1S1具体的相互作用蛋白以及作用通路,通过逆转录的方法获得了来自293T细胞的cDNA库。通过基因克隆的方法,成功克隆到AKT1S1基因,并将该基因插入至重组逆转录病毒载体pBABE-Flag质粒中,构建了Flag-AKT1S1-pBABE质粒。在辅助质粒的帮助下,在p293T细胞中包装病毒,侵染293T细胞,使用嘌呤霉素筛选目标细胞,经过蛋白质免疫印迹试验鉴定,获得了Flag-AKT1S1-pBABE稳定过表达细胞系,为下一步开展AKT1S1相互作用蛋白的质谱鉴定及其在肿瘤发生中的研究打下坚实基础。