卵巢癌腹腔转移工具细胞的构建及其应用

【目的】构建稳定共表达荧光素酶(Luc)和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的人源卵巢癌细胞SKOV3(SK-Luc-EGFP)并探究其在卵巢癌腹腔转移的体内外研究中的应用。【方法】利用重叠PCR扩增得到的Luc-T2A-EGFP基因片段,构建重组质粒pCDH-Luc-T2A-EGFP-Puro;采用三质粒慢病毒包装系统转染HEK 293T细胞,收集病毒液感染SKOV3细胞;通过嘌呤霉素筛选,流式细胞术检测,筛选高效表达EGFP的细胞(SK-Luc-EGFP),并通过体外生物发光实验验证Luc的表达。对SK-Luc-EGFP细胞进行如下应用的探究:利用流式细胞术和激光共聚焦区分SK-Luc-EGFP细胞与腹水微环境中的非肿瘤细胞,利用荧光显微镜观察SK-Luc-EGFP与间皮细胞的黏附,利用小动物活体成像仪观察SK-Luc-EGFP细胞的大网膜黏附以及体内成瘤的过程。【结果】成功构建慢病毒载体pCDH-Luc-T2A-EGFP-Puro;感染并筛选得到SK-Luc-EGFP单克隆细胞株。通过荧光显微镜和流式细胞术均能检测到EGFP的表达,细胞纯度达100%;通过流式细胞术和激光共聚焦成像可直观辨别SK-Luc-EGFP细胞与腹水微环境细胞。体外生物发光试验成功验证Luc的表达,且细胞数和生物发光信号的线性相关系数为0.9979。细胞黏附试验中通过荧光成像直接观察到SK-Luc-EGFP细胞对间皮细胞的黏附;经腹腔注射SK-Luc-EGFP细胞观察到细胞在裸鼠大网膜上的黏附;在SK-Luc-EGFP细胞建立的卵巢癌腹腔转移模型中,利用小动物活体成像仪实现对腹腔肿瘤的活体监测。【结论】SK-Luc-EGFP细胞株在卵巢癌腹腔转移的体内外研究中具有多重应用潜力。