多花黑麦草遗传连锁图的构建

利用多花黑麦草(Loliummu ltiflorum)细胞质雄性不育(CMS)F1群体(124个个体),以来自父本和母本的分离位点采用SSR、AFLP、EST-CAPS(表达序列标签酶切扩增多态性)和RGA-CAPS(抗病基因类似物酶切扩增多态性)等标记方法进行多态性的选择并对父、母本分别构建遗传连锁图。母本连锁图包含362个标记位点,分别包含SSR标记240个、AFLP标记84个、EST-CAPS标记24个和RGA-CAPS标记14个,由7个连锁群组成,覆盖全长776.4cM,各连锁群长度在85.8至135 cM之间,相邻标记之间的平均距离为2.14 cM;父本7个连锁群,包含376个标记,其中SSR标记252个、AFLP标记82个、EST-CAPS标记29个和RGA-CAPS标记13个,连锁图全长710.0 cM,相邻标记之间的平均距离为1.89 cM;标记密度高、标记分布均匀、连锁图长度中等。

分群分析法获得与多花黑麦草抗叶班病基因连锁的EST-CAPS标记

利用多花黑麦草叶斑病抗性和敏感个体杂交构建F 1分离群体,采用分群分析法(bu lked segregan t ana lys is,BSA),通过多花黑麦草表达序列标签(expressed sequence tag,EST)的PCR扩增和扩增产物的限制性内切酶酶切多态性(cleaved am p lified po lym orph ic sequence,CAPS)筛选,获得一个同多花黑麦草草抗叶斑病紧密连锁的EST-CAPS标记p56。对照多花黑麦草细胞质雄性不育(CM S)群体构建的遗传连锁图,该EST-CAPS标记位于多花黑麦草的第5遗传连锁群(LG 5)。对cDNA文库中对应于标记位点p56的EST序列片段分析和基因库搜索结果表明,该EST所编码的氨基酸序列同大麦天冬酰胺合成酶基因H vAS 1和H vAS 2的部分氨基酸序列片段同源性很高,推测位点p56所处的基因为编码多花黑麦草天冬酰胺合成酶基因。该分子标记可用于多花黑麦草分子标记辅助育种。

多花黑麦草抗病基因类似物的克隆及CAPS标记

多花黑麦草具有适应性强、生物产量高和品质好等优点,为我国南方及其他温带地区重要的牧草。本研究利用目前已克隆出的抗病基因(R基因)所编码的蛋白质结构上所具有的共同氨基酸基序NBS-LRR设计寡核苷酸简并引物,对多花黑麦草基因组进行抗病基因类似物(RGA)克隆。从克隆中筛选出具代表性的RGA克隆115个,设计RGA-STS引物113对。利用细胞质雄性不育(CMS)F1群体对RGA-STS引物进行筛选,并采用限制性内切酶酶切扩增多态序列(CAPS)法进行抗病类似物的分子标记,共检测到22对RGA-STS引物的扩增产物具多态性,22个RGA-CAPS标记均被标记于多花黑麦草遗传连锁图中。结果还表明RGA在多花黑麦草遗传连锁图中分布范围较广,并具有簇状分布特性。

与多花黑麦草抗灰叶斑病相关基因紧密连锁的RGA-CAPS标记筛选

以多花黑麦草抗灰叶斑病品种Sach iaoba、感病品种M inam iaoba及其杂种F1分离群体为材料,采用接种鉴定和分群分析法(BSA)进行抗病基因类似物限制性内切酶酶切多态性(RGA-CAPS)筛选。得到与多花黑麦草抗灰叶斑病相关基因紧密连锁的RGA-CAPS标记,该标记与灰叶斑病抗性相关基因紧密连锁,连锁距离为4.94cM。测序和BLASTX查询结果显示,该RGA与水稻的1个NBS-LRR类抗性蛋白(Genbank/NCB I:AAT81729.1)同源性高达67%,序列分析结果显示,对应于抗、感病性的该RGA片段长度均为361 bp,两片段之间存在多个单核苷酸差异(SNPs)。利用SNPs重新设计引物,并应用新设计引物成功地将RGA-CAPS标记转换成共显性STS标记。