谷氨酸棒杆菌耐受胁迫机制及工业鲁棒性合成生物学研究进展

谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum作为一般被认为具有生物安全性的一种模式工业微生物,不仅在发酵工业中成功用于大规模生产氨基酸,而且具有合成多种新型化学品的潜力。谷氨酸棒杆菌菌株在生产化合物时,经常会受到各种逆境条件的胁迫,从而降低细胞活力和生产性能。合成生物学的发展为提高谷氨酸棒杆菌的鲁棒性提供了新的技术手段。本文总结了谷氨酸棒杆菌应对发酵过程中各种胁迫的耐受机制。同时,重点介绍提高谷氨酸棒杆菌底盘细胞鲁棒性和耐受性的合成生物学新策略,包括挖掘新的抗逆元件、改造转录调控因子、利用适应性进化策略挖掘抗逆功能模块等。最后,从生物传感器、转录调控因子的筛选和设计、多种调控元件利用等方面对提高谷氨酸棒杆菌底盘细胞鲁棒性进行了展望。

谷氨酸棒杆菌anti-σ因子CseE及其突变体与σ因子SigE的相互作用分析

【目的】谷氨酸棒杆菌是重要的氨基酸生产菌株,本研究针对SigE与ZAS家族蛋白CseE相互作用机制进行探索研究,重点分析CseE突变体影响与SigE结合能力的机制。【方法】本研究选择谷氨酸棒杆菌ATCC 13032来源的SigE和CseE蛋白为研究目标,利用遗传学方法获得过表达的重组谷氨酸棒杆菌,通过RT-qPCR研究SigE调控sigE和cseE的转录情况。同时,利用ITC和His pull-down实验验证ZAS家族的CseE蛋白与Zn^(2+)及SigE的结合情况。之后对CseE蛋白进行功能域分析、多序列比对,研究功能域关键氨基酸位点对SigE结合能力的影响。其次对SigE和CseE蛋白进行分子对接和动力学模拟,分析关键氨基酸影响其结合的机制。【结果】谷氨酸棒杆菌SigE调控基因sigE和cseE的转录并且其活性受CseE蛋白控制。CseE蛋白为ZAS家族蛋白,具有Zn^(2+)结合能力。CseE_(His83A)、CseE_(cys87A)和CseE_(cys90A)突变体不会影响与SigE的结合能力,而CseE_(C87A-C90A)和CseE_(His83A-C87A-C90A)突变体与SigE的结合能力略有下降。分子动力学模拟发现SigE-CseE_(C87A-C90A)和SigE-CseE_(His83A-C87A-C90A)之间的结合能量为−17.23 kcal/mol和−14.06 kcal/mol,分别比未突变体系结合能量降低22.8%及36.9%。【结论】谷氨酸棒杆菌SigE通过聚集RNA聚合酶来调控基因sigE和cseE的表达。CseE蛋白属于ZAS家族,具有Zn^(2+)结合能力同时通过与SigE蛋白互作来抑制SigE活性。CseE_(C87A-C90A)及CseE_(His83A-C87A-C90A)突变体能影响与SigE结合的能力,减弱对SigE活性的控制。本研究产生的三维结构和确定的氨基酸关键位点为后续探索谷氨酸棒杆菌SigE和CseE响应环境压力机制提供了理论基础。

钝齿棒杆菌黄素血红蛋白Hmp在L-精氨酸合成中的作用

钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)SYPA5-5是本实验室选育的一株L-精氨酸高产菌,基于前期转录组和蛋白组数据分析,发现黄素血红蛋白(flavohemoglobin,Hmp)在高氮源相对于低氮源条件下表达水平上调,进一步研究Hmp的抗氧化胁迫功能和在L-精氨酸合成中的作用.构建了hmp过表达和敲除菌株,首先以Hmp蛋白为研究对象,分析Hmp的圆二色谱结构,用SWISS-MODEL建模分析,测其NAD(P)H氧化酶酶活,验证了Hmp的结构与功能.接下来研究Hmp与氧化应激之间的关系,首先测定发酵过程胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平以及超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)酶活,最后通过5-L发酵罐扩大发酵体系来探究Hmp在L-精氨酸合成中的作用.过表达hmp在发酵过程中降低了活性氧水平,分别提高了9.2%和8.7%的SOD和CAT酶活,促进了菌体生长代谢和提高目标代谢产物的积累.通过检测发酵过程的细胞干重、葡萄糖含量和L-精氨酸产量,发现hmp过表达菌株Cc-hmp的L-精氨酸产量和得率相比于原始菌株Cc5-5分别提高了19.7%和29.6%,hmp敲除菌株Cc-Δhmp的L-精氨酸产量和得率相比于原始菌株Cc5-5分别减少37.9%和14.8%.本研究表明高氮高溶氧条件下,使用发酵法生产L-精氨酸的过程中,氧化应激的产生及带来的氧化损伤不可避免,Hmp可以有效抵抗胞内氧化应激,改善胞内的氧化还原状态,维持一个良好的胞内环境,从而提高L-精氨酸的产量.(图10表3参31)